Biocatalizadores de origen procariota para aplicaciones en biorrefinería. Estudios genómicos y tecnológicos

Abstract

La biomasa lignocelulósica contiene los polisacáridos renovables más abundantes de la naturaleza y su explotación no compite con los alimentos. Por lo tanto, es considerada como una materia prima adecuada para su utilización en industrias de base biológica, en las que las enzimas capaces de degradar y modificar carbohidratos son clave para su aprovechamiento en un contexto de biorrefinería. El eje principal de esta tesis se dirige a estudios fisiológicos y moleculares de bacterias productoras de enzimas carbohidrato-activas, así como a la producción y caracterización de estas últimas, como un aporte al desarrollo de biocatalizadores para tecnologías sustentables. A partir de una colección de procariotas autóctonos aislados de ambientes estratégicos, Cohnella sp. AR92 fue seleccionada por su novedosa filiación taxonómica y destacada actividad xilanolítica obtenida en un medio mineral suplementado con bagazo de caña de azúcar pretratado con álcali, un subproducto agroindustrial. Por medio de diseños factoriales, se optimizó la composición del medio de cultivo para la producción de xilanasas, alcanzándose 15,8 UI/mL, con un incremento del 20 % con respecto al medio inicial. Posteriormente, mediante el estudio de las condiciones operativas, la producción enzimática fue mejorada aproximadamente tres veces (45 UI/mL), cuando el medio óptimo se inoculó con 5*107 UFC/mL y se incubó a 200 rpm, pH 7,0 y 25 °C durante 96 h.El preparado xilanolítico obtenido fue estable a temperaturas moderadas (30 °C - 40 °C) dentro de un amplio rango de pH (4 a 10). Su actividad no fue modificada significativamente por una variedad de cationes y aditivos ensayados, y retuvo más del 50 % de actividad frente a NaCl 3 M y a etanol 10 % (v/v). El cóctel xilanolítico hidrolizó eficazmente las hemicelulosas presentes en los residuos lignocelulósicos de origen agroindustrial evaluados, rindiendo xilosa y xilooligómeros, lo cual evidencia su potencial utilidad en la el aprovechamiento integral de la biomasa vegetal.Cohnella sp. AR92 posee un genoma de 6,0 Mpb y un contenido de GC de 56,0 %. Al igual que otros miembros de Paenibacillaceae, contiene abundancia y redundancia de genes que codifican para enzimas carbohidrato-activas, algunos de los cuales se agrupan en clusters. Dentro de Cohnella spp., la cepa AR92 presenta una destacada diversidad de este tipo de enzimas. El secuenciado del proteoma intra y extracelular de la cepa AR92 frente a bagazo de caña de azúcar crudo, bagazo pretratado con álcali y salvado de trigo permitió comprobar que gran parte de las enzimas involucradas en la degradación del xilano fueron detectadas en los tres sustratos analizados, siendo mayoritarias en bagazo pretratado con álcali. La principal glicósido-hidrolasa encontrada fue un GH11, seguida de varias enzimas GH10 multimodulares. El clonado y caracterización de la endo-1,4-β-xilanasa GH11 reveló como productos mayoritarios de degradación del xilano los xilooligómeros X3 a X6, lo cual pone de manifiesto su potencial para la generación de moléculas prebióticas.

The lignocellulosic biomass contains the most abundant renewable polysaccharides of nature whose exploitation does not compete with food. Consequently, it is considered as a suitable raw material for use in bio-based industries, where polysaccharide degrading and modifying enzymes are of key relevance within a biorefinery context. The main goal of this thesis is focus to physiological and molecular studies of carbohydrate-active enzyme bacterial producers as well as their enzyme assessment as a contribution towards the development of biocatalysts for sustainable technologies. Starting from a collection of autochthonous prokaryotes isolated from strategic environments, Cohnella sp. AR92 was selected for its novel taxonomic affiliation and outstanding xylanolytic activity obtained on a mineral medium supplemented with alkali pre-treated sugarcane bagasse, an agro-industrial by-product. The culture medium components that promoted the enzymatic production were optimized by means of statistical designs, leading to 15.8 IU/mL and an increment of 20 % with respect to the initial medium. Then, the operative conditions were analyzed, which allowed to achieve enzyme titers of 45 IU/mL on the optimal medium inoculated with 5*107 CFU/mL and incubated at 200 rpm, pH 7.0 and 25 °C for 96 h. The xylanolytic preparation obtained was stable at moderate temperatures (30 °C - 40 °C) within a wide range of pH (4 to 10). The enzyme activity was not significantly modified by a variety of cations and additives tested, and more than 50 % of the activity was also retained against 3M NaCl and 10 % ethanol (v/v). The xylanolytic cocktail effectively hydrolyzed the hemicelluloses of the lignocellulosic residues assayed, yielding xylose and xylooligomers, which constitutes an evidence of its potential for an integral utilization of the vegetal biomass. The genomic analysis of Cohnella sp. AR92 revealed a 6.0 Mpb genome size with a 56.0 % GC content. Its annotation showed abundance of genes encoding redundant carbohydrate-active enzymes, many of them were grouped into clusters, features also observed in other members of Paenibacillaceae. Within Cohnella spp., the strain AR92 presented a large diversity of this type of enzymes compared with related isolates. The intra and extracellular proteome of the strain was sequenced from cells developed on raw sugarcane bagasse, alkali pretreated sugarcane bagasse and wheat bran. In all the conditions assayed, most of the potential xylan degrading enzymes were detected, mainly on alkali pretreated sugarcane bagasse. The main glycoside hydrolase identified was GH11, followed by several multimodular GH10 enzymes. The further cloning and characterization of the endo-1,4-β-xylanase GH11 revealed xylooligomers from X3 to X6 as the major products of xylan degradation, results that disclosed its potential for the generation of prebiotic molecules.