Reproducción a partir de esporas de Gigartina skottsbergii y Sarcothalia crispata (Rhodophyta) de la Patagonia argentina y aplicación farmacéutica de sus carragenanos

Abstract

Las macroalgas han sido utilizadas como alimento desde tiempos ancestrales y actualmente también son usadas con diversas aplicaciones en distintas industrias. Las algas rojas Gigartinales constituyen un recurso económico de gran valor debido a su contenido de carragenanos. Éstos son polisacáridos sulfatados presentes en la pared celular, ampliamente utilizados como gelificantes, estabilizantes y espesantes en las industrias alimentaria, cosmética y farmacéutica. En Argentina, Gigartina skottsbergii ha sido explotada para la obtención de carragenanos desde la década del 70 y Sarcothalia crispata ha sido señalada como materia prima potencial con este fin. Estas especies pertenecen a la familia Gigartinaceae, cuyos miembros se caracterizan por tener gametofitos que producen carragenanos gelificantes del tipo Kappa/Iota-, y tetrasporofitos productores de carragenanos espesantes o viscosantes del tipo Lambda-. En base a estos antecedentes, el objetivo general de esta tesis fue el estudio de las macroalgas carragenófitas Gigartina skottsbergii y Sarcothalia crispata del Mar Argentino, incluyendo aspectos morfológicos y reproductivos relevantes con el fin de obtener información que sirva de base para el desarrollo de futuros esporocultivos comerciales y para el manejo de praderas naturales. Este estudio también estuvo orientado a la búsqueda de aplicaciones novedosas de los carragenanos extraídos de estas especies. Para llevar a cabo los objetivos mencionados, se realizaron ensayos a escala de laboratorio para determinar la disponibilidad de carpósporas y tetrásporas de G. skottsbergii y S. crispata coleccionadas en Cabo Raso (Chubut, Argentina), así como la optimización de las condiciones para su liberación a partir de frondes fértiles. Se iniciaron esporocultivos in vitro para estudiar la germinación de las esporas y evaluar sustratos potenciales para el asentamiento y desarrollo de las plántulas. Además, se realizó la extracción y caracterización de los carragenanos de las generaciones gametofíticas de ambas especies y se llevó a cabo la formación de complejos interpolielectrolito (IPECs) con los mismos y el copolímero Eudragit E. Estos IPECs fueron evaluados para la liberación controlada de ingredientes farmacéuticos activos utilizando ibuprofeno como fármaco modelo. La disponibilidad estacional de esporas de G. skottsbergii resultó limitada, obteniéndose cantidades considerables de carpósporas y tetrásporas únicamente en los meses de invierno y primavera. La aplicación de diferentes métodos de inducción de la liberación de esporas (desecación y shock osmótico) no resultó en una mayor obtención de esporas, registrándose valores similares a los obtenidos con la liberación espontánea.Por otro lado, la incubación de las frondes cistocárpicas y tetraspóricas bajo distintas temperaturas no mostró un efecto en la liberación de carpósporas y tetrásporas respectivamente, mientras que el aumento de horas de luz tuvo un efecto positivo en la liberación de tetrásporas, aunque esto no se observó en la liberación de carpósporas. Los esporocultivos iniciados en laboratorio, tanto con carpósporas como con tetrásporas de esta especie, mostraron bajas tasas de supervivencia de plántulas en todos los sustratos evaluados (vidrio, conchillas y piedras). En S. crispata, la aplicación de métodos de inducción (desecación, shock osmótico, baja temperatura) tampoco tuvo efecto en la liberación de carpósporas o tetrásporas. Por ello, para ambas especies, la liberación espontánea de esporas sería un método adecuado para la obtención tanto de carpósporas como de tetrásporas, por ser menos laboriosa y costosa que los demás métodos evaluados. En S. crispata, la liberación de esporas por área de fronde resultó mayor en talos tetraspóricos que en talos cistocárpicos, aspecto relevante a la hora de iniciar cultivos selectivos para la obtención de materia prima específica para la extracción de un tipo determinado de carragenano. Las plántulas tetraspóricas y gametofíticas desarrollaron sobre los cuatro sustratos evaluados (vidrio, sogas, conchillas y piedras), registrándose las mayores densidades, al igual que un adecuado crecimiento, sobre conchillas y piedras a los tres meses de cultivo. Estos sustratos, al ser obtenidos del ambiente natural, no implicarían un riesgo para su inserción en el ecosistema marino. Las sogas no presentaron altas densidades ni buen crecimiento de plántulas. La caracterización de los carragenanos de las generaciones gametofíticas de ambas especies dio como resultado un producto mayormente Kappa, aunque con cantidades menores pero considerables de estructuras Iota y Nu. Los IPECs formados entre estos carragenanos y el copolímero Eudragit E se utilizaron para la elaboración de comprimidos conteniendo ibuprofeno. Los IPECs mostraron características particulares en su composición química y a nivel ultraestructural en cada una de las especies, lo cual se vio reflejado en una liberación más lenta de ibuprofeno en el IPEC formado por el carragenano de S. crispata. El trabajo realizado aporta información valiosa para el manejo de praderas de Gigartina skottsbergii. De acuerdo a los resultados obtenidos, la posibilidad de implementar esporocultivos piloto de Sarcothalia crispata se presenta con mayor factibilidad que en el caso de G. skottsbergii. La liberación controlada de ingredientes farmacéuticos activos constituye una aplicación novedosa de los carragenanos de estas dos especies nativas de la Patagonia argentina.

Seaweeds have been used as food since ancestral times and, nowadays, they are also employed with diverse applications in different industries. The red algae belonging to the order Gigartinales are a valuable economic resource because of their high carrageenan content. These are cell wall sulphated polysaccharides, widely used as gelling, stabilizing, and viscosity binding agents in the food industry, cosmetics and pharmaceutical formulations. In Argentina, Gigartina skottsbergii has been exploited for carrageenan production since 1970, and Sarcothalia crispata has been pointed out as potential raw material for this purpose. These species belong to the Gigartinaceae family, whose members are characterized for having gametophytes that produce Kappa/Iota-carrageenan and tetrasporophytes that produce Lambda-carrageenan. Based on this background information, the main objective of this thesis was to study the carrageenophytes Gigartina skottsbergii and Sarcothalia crispata from the Argentinian Sea, including relevant morphological and reproductive aspects, with the aim of obtaining basic information for the implementation of future spore cultures and for the management of natural beds. This study was also oriented to the pursuit of novel applications for the carrageenans extracted from these species. To carry out the mentioned objectives, laboratory experiments were performed to determine the availability of carpospores and tetraspores from G. skottsbergii and S. crispata collected near Cabo Raso (Chubut, Argentina), as well as the optimization of the conditions for their release from fertile fronds. In vitro spore cultures were initiated to study spore germination and to evaluate potential substrates for the settlement and development of germlings. In addition, the extraction and characterization of carrageenans from the gametophytic generations of both species was carried out, as well as the preparation of interpolyelectrolyte complexes (IPECs) among each carrageenan and the copolymer Eudragit E. These IPECs were tested for the release of active pharmaceutical ingredients using ibuprofen as a model drug. The availability of G. skottsbergii spores was limited throughout the year, obtaining considerable amounts of both carpospores and tetraspores only during winter and spring. The application of different induction methods for spore release (desiccation and osmotic shock) did not result in a higher amount of spores, obtaining similar values than with spontaneous discharge. Incubation of fertile cystocarpic and tetrasporic fronds under different temperatures did not have an effect on the release of carpospores and tetraspores, respectively, while the increase in daylight hours had a positive effect on the release of tetraspores, not showing the same effect on that of carpospores. Laboratory cultures of G. skottsbergii carpospores and tetraspores showed low survival of sporelings on all the evaluated substrates (glass, shells and gravel). In S. crispata, the application of induction methods (desiccation, osmotic shock, low temperature) had also no effect on the release of carpospores or tetraspores. For this reason, spontaneous discharge of spores would be and adequate method for obtaining both carpospores and tetraspores of both species. This method would be less expensive and laborious than the other evaluated ones. In S. crispata, spore release per frond area was higher for tetrasporic than for cystocarpic fronds, which is a relevant aspect when initiating selective cultures for obtaining specific raw material for the extraction of certain type of carrageenan. Carposporelings and tetrasporelings developed on the four evaluated substrates (glass, ropes, shells and gravel), registering the highest densities, as well as an adequate growth, on shells and gravel on the third month of culture. As these substrates were obtained from the natural environment, they would not imply a risk for the marine ecosystem when being transplanted to the sea. Ropes did not have high densities or good growth of germlings. Characterization of carrageenans of the gametophytic generations of both species indicated a Kappa-carrageenan as a major product. However, minor but considerable amounts of Iota and Nu structures were also present. The IPECs prepared with each carrageenan and the copolymer Eudragit E were employed for the preparation of tablets containing ibuprofen. The IPECs showed particular characteristics regarding their chemical composition and ultrastructure on each species, which was supported by a slower ibuprofen release profile for the IPEC prepared with the carrageenan from S. crispata. This study presents valuable information for the management of Gigartina skottsbergii natural beds. According to the obtained results, the possibility of implementing pilot spore cultures of Sarcothalia crispata is presented with more feasibility than the case of G. skottsbergii. The controlled release of active pharmaceutical ingredients constitutes a novel application for the carrageenans of these native species from the Argentinian Patagonia.