Función de la síntesis, acumulación y transporte de ureidos en Arabidopsis thaliana L.

Abstract

Los ureidos, alantoína y ácido alantóico, constituyen la principal forma de transporte del nitrógeno orgánico a larga distancia en varias especies tropicales de Leguminosas nodulantes. En otras especies vegetales se han determinado variaciones en el contenido de ureidos en respuesta a diferentes condiciones de estrés, pero poco se conoce sobre los mecanismos moleculares subyacentes. En este trabajo se observó que el estrés salino promueve la acumulación de alantoína en Arabidopsis principalmente por la represión transcripcional de AtALN (Arabidopsis thaliana Allantoinase). La importancia de este fenómeno durante la respuesta al estrés fue determinada a partir del análisis comparativo de plantas con distintas capacidades para acumular alantoína. Las líneas mutantes en AtALN (aln-1 y aln-2) acumularon mayores niveles de alantoína y presentaron una mejor tolerancia al estrés salino que las plantas de tipo silvestre (WT, wild-type). Por otro lado, se desarrollaron líneas transgénicas pRD29A:ALN/aln-2 que degradaron alantoína en respuesta al estrés. El fenotipo sensible de estas plantas indica que la acumulación de alantoína por represión transcripcional de AtALN es crítica durante el estrés salino. También se observó una fuerte relación entre la acumulación de alantoína en la planta y la tolerancia al estrés oxidativo inducido por metilviológeno. Por lo tanto, la alantoína acumulada podría señalizar la respuesta antioxidante y así tener un rol protector en los eventos oxidativos que ocurren durante distintos estreses fisiológicos en Arabidopsis.Complementariamente se estudió la implicancia de AtUPS5 (Arabidopsis thaliana Ureide Permease 5) en el transporte de alantoína en Arabidopsis. El fenotipo sensible y la acumulación de alantoína en las raíces de líneas mutantes en AtUPS5 (ups5-1 y ups5-2) durante el estrés salino sugieren que el transporte de alantoína mediado por AtUPS5 es un evento necesario durante la tolerancia al estrés en Arabidopsis. Para conocer el destino subcelular de las variantes de splicing AtUPS5L (Large) y AtUPS5s (short), se generaron plantas transgénicas que expresan proteínas fluorescentes fusionadas a sus dominios citosólicos centrales. Se comprobó la funcionalidad de estas construcciones en Arabidopsis mediante experimentos nutricionales y de estrés salino. Ambas variantes se localizaron en el retículo endoplásmico, pero la variante AtUPS5L también se localizó en la red del trans-Golgi/endosoma temprano (TGN/EE). El destino subcelular de las variantes de AtUPS5 sugiere que podrían tener distintos roles en la distribución de alantoína entre compartimentos subcelulares en las células vegetales.También se observó que los ureidos se acumularonn en plantas que crecieron en condiciones de baja relación C/N dadas por oscuridad total o exceso de nitrógeno inorgánico en el medio. Sin embargo, cantidades elevadas de NH4+ indujeron particularmente la acumulación de alantoína en Arabidopsis. Esto fue revertido por el agregado de sacarosa en el medio de cultivo. El fenotipo sensible de las líneas ups5-1 y aln-2 al exceso de NH4+ sugiere que el transporte de alantoína mediado por AtUPS5 y la expresión de AtALN son procesos necesarios para abastecer a la planta con el nitrógeno acumulado en la alantoína en estas condiciones.

The ureides,allantoin and allantoate, serve as major organic compoundsforlong-distance nitrogen transportin various species oftropical legumes. In other plant species, variations in ureides concentrations have been observed under different stress conditions, but the underlying molecular mechanisms remained poorly understood. In this work, we observed that salt stress triggers allantoin accumulation in Arabidopsis mainly by AtALN(Arabidopsis thaliana Allantoinase) down regulation. The relevance of this process during stress response was established by the comparative analysis of plants with different capacities of allantoin accumulation. AtALNmutant lines (aln-1 and aln-2) accumulated higher allantoin levels and presented a better tolerance to salt stress than WT (wild-type) plants. On the other hand, we developed pRD29A:ALN/aln-2 transgenic lines that consumed allantoin in response to stress. The sensitive phenotype of this plants indicated that allantoin accumulation by AtALN down regulation is critical for salt stress tolerance. We observed also a strong relationship between allantoin accumulation and tolerance to metilviologen induced oxidative stress. Therefore, the accumulated allantoin could signal antioxidant response and/or have a protective role in the oxidative events during physiological stresses in Arabidopsis.In addition,a potencial role of allantoin transport mediated by AtUPS5 (Arabidopsis thaliana Ureide Permease 5was considered. The sensitive phenotype and allantoin accumulation in the roots of AtUPS5 mutant lines(ups5-1y ups5-2)during salt stress suggest that allantoin transport mediated by AtUPS5 is an important event for salt stress alleviation in Arabidopsis.To study the subcellular fateof splicing variants AtUPS5L (Large) and AtUPS5s (short), transgenic plants that expresed fluorescent proteins fused to their central loops were generated. The capacity of these fusion proteins to correctly complement the function of native ones was proved by nutritional and salt stress experiments. Both variants were localized in the endoplasmic reticulum, but the AtUPS5L variant was also localized in the trans-Golgi network/early endosome (TGN/EE). The subcellular fate of AtUPS5 splicing variants suggest that they could have different roles in allantoin distribution between subcelular compartments in the plant cells. It was also observed that ureides accumulated in plants that grow under low C/N ratio conditions given by total darkness or high inorganic nitrogen in the culture media. However, high NH4+concentrations induced particularly allantoin accumulation in Arabidopsis plants. This was reverted by adding sucrose in the culture media. The sensitive phenotype to high NH4+of up5-1 and aln-2 lines suggest that allantoin transport by AtUPS5 and AtALNexpression are neccesary processes to metabolizethe nitrogen accumulated in form of allantoin under these conditions.