Estudio de la degradación de los isómeros del hexaclorociclohexano por actinobacterias regionales

Abstract

El hexaclorociclohexano (HCH) es un compuesto organoclorado obtenido porsíntesis química que ha sido utilizado principalmente como plaguicida para protegercultivos agrícolas. El mismo fue utilizado en dos formulaciones, como grado técnico(mezcla de isómeros) y el isómero γ-HCH purificado también llamado lindano. Losisómeros del hexaclorociclohexano son contaminantes orgánicos peligrosos debido a supersistencia en el ambiente y a su elevada toxicidad. La aplicación no controlada y elmanejo inadecuado del HCH condujeron a la contaminación de suelos, biota y recursoshídricos. Se reportaron áreas altamente contaminadas con HCH en Japón, Canadá,Sudáfrica, India, Argentina, Alemania y Estados Unidos. La necesidad de remediarestos sitios contaminados condujo al desarrollo de nuevas tecnologías como labiorremediación, que presenta algunas ventajas frente a los métodos tradicionales.El phylum Actinobacteria se caracteriza por su versatilidad metabólica, en el queel género Streptomyces es reconocido por su gran potencial biotecnológico. Lascaracterísticas fisiológicas y genéticas de este género lo hacen apropiado para participaren los procesos de biorremediación, en comparación con otras bacterias. La cepaStreptomyces sp. M7 fue aislada de sedimentos altamente contaminados en la provinciade Tucumán (Argentina), posee la capacidad de remover lindano de medios líquidos ysuelo. Si bien se ha descripto una vía metabólica para la degradación del lindano en elgénero Sphingobium, no se conoce aún la vía de degradación de lindano porStreptomyces ni el análisis del contexto metabólico durante la degradación.En este trabajo, se determinó que Streptomyces sp. M7 posee la capacidad deutilizar los isómeros α- y β-HCH como fuente de carbono y de removerlos del medio decultivo. Además, es capaz de remover los isómeros α-, β- y γ-HCH en forma conjunta.Se determinó la liberación de iones cloruros al medio de cultivo como una medida de ladegradación de HCH. Asimismo, se identificaron intermediarios metabólicos durante ladegradación de los isómeros α- y β-HCH. Para dilucidar la vía de degradación del γ-HCH y comprender su contexto metabólico en Streptomyces sp. M7 se utilizaronmetodologías de avanzada, tales como proteómica cuantitativa libre de geles, RT-qPCRy diferentes análisis bioinformáticos. Se identificaron las enzimas pertenecientes a la víaalta de degradación del HCH. Las mismas fueron determinadas en mayor abundanciarelativa cuando se utilizó como fuente de carbono el γ-HCH. Asimismo, se demostróque la mineralización de lindano es factible debido a que fueron identificadas proteínaspertenecientes a una variante inusual de la vía baja de degradación. También, losresultados obtenidos permitieron descifrar el contexto metabólico en el cual tiene lugarla degradación del γ-HCH, demostrando que las etapas degradativas de esta vía estánsustentadas por un catabolismo activo que suministra energía y equivalentes dereducción en forma de NADPH.Los resultados obtenidos en el presente trabajo de Tesis Doctoral contribuyerona dilucidar la vía metabólica por la cual Streptomyces sp. M7 es capaz de degradar elhexaclorociclohexano, aportando información sobre el metabolismo de compuestosclorados en actinobacterias y conocimientos para optimizar procesos degradativos enStreptomyces sp. M7.

Hexachlorocyclohexane (HCH) is a chlorinated compound obtained by chemical synthesis, which has been used mainly as a pesticide to protect agricultural crops. The HCH was used in two formulations i) technical grade (mixture of isomers) and ii) purified γ-HCH isomer commercially known as lindane. HCH isomers were classified as a dangerous organic contaminant due to their persistence in the environment and acute toxicity. Uncontrolled application and inappropriate handling of HCH led to contamination of soils, biota and waters. Highly contaminated areas with HCH were reported in Japan, Canada, South Africa, India, Argentina, Germany, Eastern Europe, Greece and United States. The need to remedy these contaminated sites, led to development of new technologies such as bioremediation processes, which have advantages over traditional methods. Actinobacteria is a diverse phylum characterized by its metabolic versatility. Within actinobacteria, genus Streptomyces is recognized by its biotechnological potential. Physiological and genetic features of this genus make it more appropriate for bioremediation processes compared with other bacteria. Streptomyces sp. M7, isolated from a highly polluted area in Tucumán (Argentina), is able to remove lindane from liquid culture media and different kind of soils. Nevertheless, degradation pathway used by this strain was not elucidated. Complete degradation pathway of lindane was only proposed in the genus Sphingobium although its metabolic context was never considered. In this study, the ability of Streptomyces sp. M7 to use α- and β-HCH isomers as a carbon source and remove them from the culture medium was determined. It was observed that M7 is also able to remove α-, β- and γ-HCH isomers when they are together in the culture medium. Chloride ions released into the culture medium and metabolic intermediates during the degradation of the α- and β-HCH isomers were determined. Moreover, we used MS-based label-free quantitative proteomic, RT-qPCR and exhaustive bioinformatic analysis to understand lindane degradation and its metabolic context in Streptomyces sp. M7. We identified the proteins involved in the up-stream degradation pathway, which are the responsible for initial dechlorination of the lindane molecule. In addition, proteomic results demonstrated that mineralization of lindane is feasible since proteins from an unusual down-stream degradation pathway were also identified. Degradative steps were supported by an active catabolism that supplied energy and reducing equivalents in the form of NADPH. To our knowledge, this is the first study in which degradation steps of an organochlorine compound and metabolic context are elucidate in a biotechnological genus as Streptomyces. These results serve as basement to study other degradative actinobacteria and to improve the degradation processes of Streptomyces sp. M7.