La entrada de virus dengue a líneas celulares humanas en la infección primaria en ausencia o presencia de anticuerpos

Abstract

Actualmente, casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de contraer virusdengue (DENV), agente patógeno que puede causar una infección aguda febril autolimitada o progresara formas más severas de enfermedad, con una tasa de mortalidad de 2,5 %. A pesar de representar ungrave problema para la salud pública, no existen vacunas ni quimioterapias disponibles para DENV. Laentrada del virus a la célula huésped es una interesante estrategia antiviral ya que permite bloquear elcomienzo de la infección viral. En el caso de DENV, sólo se ha estudiado hasta el presente el modo deentrada en líneas celulares epiteliales o fibroblásticas de mamíferos y de mosquito, con resultadoscontroversiales. El presente trabajo de tesis se enfocó en el estudio del mecanismo de entrada de estepatógeno a células mieloides humanas, más representativas de la infección natural, y la implicancia quepudiese tener en la quimioterapia antiviral. Mediante la utilización de inhibidores químicos de lasdistintas vías endocíticas, medida de infectividad por formación de placas, determinaciones de RNAviral por RT-PCR en tiempo real y técnicas de microscopía de fluorescencia y electrónica, se demostróque los dos serotipos DENV-1 cepa Hawaii y DENV-2 cepa NGC utilizan una vía clásica de endocitosisdependiente de clatrina y dinamina para entrar en células humanas U937, de origen monocítico, yK562, de origen ertitroleucémico. En la infección de ambas células en presencia de anticuerpos noneutralizantes anti-DENV, condiciones en que hay incremento de la infección in Vitro y puedenexplicarse las formas más severas de la enfermedad in vivo, se observó que DENV-2 utiliza diferentesvías de entrada, mediadas o no por clatrina, según el receptor FcR involucrado en el proceso. Tambiénse evaluó en los mismos sistemas la actividad antiviral del carragenano , polisacárido sulfatado queinhibe la adsorción e internalización de DENV-2 en células Vero, encontrándose también una relaciónentre la susceptibilidad antiviral y el tipo de receptor empleado para la entrada mediada poranticuerpos. Finalmente, se realizó un estudio de la dependencia de colesterol para la infección conDENV, concluyendo que el contenido adecuado de colesterol en la envoltura viral, no así en lamembrana celular, sería determinante para lograr la fusión de ambas membranas y alcanzar unainfección productiva. La caracterización de la vía de entrada en células mieloides y el rol del colesterolviral aporta nueva información para comprender los factores involucrados en la infección de DENV yfavorecer el diseño y utilización de nuevas terapias antivirales más efectivas.

At present, a high proportion of world population is at risk of infection with dengue virus (DENV), a pathogen causing either a mild febrile illness or more severe forms of disease, with 2.5 % mortality. Although DENV represents a serious health problem worldwide, no specific chemotherapy or vaccine is currently available. Virus entry is an attractive antiviral strategy to block initiation of infection. For DENV, the mode of entry into the host cell has been studied only in fibroblastic or epithelial cell lines, derived from mammals or mosquitoes, with controversial results. In the present study, the entry of DENV into human myeloid cell lines, a model more representative of the natural infection, was analyzed as well as the relationship between mode of entry and antiviral susceptibility to sulfated polysaccharides. By using biochemical inhibitors of endocytic routes, infectivity titrations by plaque formation, viral RNA determinations by quantitative RT-PCR, fluorescence and electron microscopy, a clathrin- and dynamin-mediated endocytosis was demonstrated for entry of both serotypes DENV-2 strain NGC and DENV-1 strain Hawaii into human myelomonocytic U937 and erithroleukaemic K562 cell lines. When both cells were infected with DENV-2 in the presence of nonneutralizing anti-DENV antibodies, conditions which allow an enhancement of infection in vitro and lead to severe forms of disease in vivo, the route of entry was clathrin-mediated or not, according to the receptor FcR involved in the infective process. Furthermore, the antiviral activity in both cell systems of carrageenan, a sulfated polysaccharide known to inhibit DENV-2 adsorption and uncoating in Vero cells, was also evaluated. A relationship between antiviral susceptibility to carrageenan and the type of receptor employed for antibody-mediated entry was observed. Finally, studies about the cholesterol-dependence for DENV infection have shown that the envelope cholesterol is a critical factor in the fusion process for DENV entry whereas cell membrane cholesterol is not involved. The characterization of the mode of entry in myeloid cells and the role of viral cholesterol contributes to the knowledge of factors involved in DENV infection and the design and usage of new and more effective antiviral therapies.