Estudio proteómico para mejorar el reactivo PPD-B utilizado en el diagnóstico de tuberculosis bovina: Producción de nuevas mezclas enriquecidas con los componentes más antigénicos de la PPD-B

Abstract

La reacción de hipersensibilidad retardada (DTH) producida por la aplicación intradérmica del derivado proteico purificado de una cepa de M. bovis (PPD-B) y la prueba que mide liberación de interferón-gamma (IFN-ϒ) son usadas para el diagnóstico de tuberculosis bovina (TBB). La especificidad de estas pruebas puede verse comprometida si se utiliza PPD-B, debido a reaccionantes positivos por sensibilización con otras micobacterias. En el presente estudio evaluamos dichas pruebas con dos mezclas conteniendo proteínas recombinantes de M. bovis: Mezcla 1 (M1): con ESAT-6, CFP-10 y MPB83; y mezcla 2 (M2): con ESAT-6, CFP-10, MPB83, HspX, TB10:3 y MPB70. Las mezclas M1, M2 y PPD-B aplicadas intradérmicamente en cobayos sensibilizados con M. bovis mostraron respuestas similares. Sin embargo, M1 indujo una reacción significativamente menor que la PPD-B en cobayos sensibilizados con M. avium. En bovinos, utilizando M1 en la prueba de IFN-γ se obtuvo mayor especificidad que con PPD-B o M2, dado que M1 fue mínimamente detectada por animales con paratuberculosis (PTB) o experimentalmente vacunados con BCG. Para optimizar estas mezclas, se obtuvieron diferentes fracciones de las PPD-B identificándose 7 proteínas en aquellas fracciones más inmunogénicas: MPB70, MPB83, CFP10, CFP2, FixB, PepA y HspX. Al utilizar M1 con FixB en la prueba de IFN-γ aumentó el reconocimiento de animales en un rodeo con TBB, sin reaccionar animales de un rodeo con PTB. Nuestros resultados demuestran que esta nueva mezcla antigénica es detectada específicamente por animales con TBB, mientras que el reactivo PPD-B fue detectado por animales infectados con otras micobacterias.

The delayed type hypersensitivity skin test (DTH) and the interferon-gamma (IFN-γ) assay are used for the diagnosis of bovine tuberculosis (TBB). However, the specificity of these tests is compromised because both are based on the response against purified protein derivative of Mycobacterium bovis (PPD-B). In the current study, we assessed the potential of two cocktails with M. bovis recombinant proteins: Cocktail 1 (C1) contained ESAT-6, CFP-10 and MPB83, and cocktail 2 (C2) with ESAT-6, CFP-10, MPB83, HspX, TB10:3 and MPB70. C1, C2 and PPD-B showed similar response by DTH in M. bovis-sensitized guinea pigs. Importantly, C1 induced a significantly lower response than PPD-B in M. avium-sensitized guinea pigs. In cattle, C1 had better performance diagnostic than PPD-B and even than C2 by IFN-γ assay; indeed, C1 detected animals with TBB, with the least detection of animals either vaccinated with BCG or with paratuberculosis. For an optimization of the cocktails, we obtained different protein fractions of PPD-B and tested them in experimentally M. bovis-infected cattle. In a fraction highly reactive seven proteins were identified: MPB70, MPB83, CFP10, CFP2, FixB, PepA and HspX. The inclusion of FixB in C1 enhanced the recognition of naturally M. bovis-infected cattle by IFN-γ assay without compromising specificity. Our data provide a promising basis for the future development of a cocktail for detection of TBB without interference by the presence of animals sensitized or infected with other mycobacteria.