Diagnóstico molecular de Porphyromona gingivalis: estandarización del método

Abstract

El objetivo del presente trabajo fue estandarizar y optimizar la técnica de PCR convencional para detección de Porphyromonas gingivalis ATCC 33277. Material y métodos: Las cepa de P. gingivalis ATCC33227 se sembró en agar Bruella enriquecido con sangre de carnero, suplementado con hemina y Vitamina K. El ADN se extrajo empleando el protocolo que emplea Bromuro de cetil trimetilamonio (CTAB) .Se evaluó la cantidad y calidad del material genético obtenido con el fotómetro UV Ampli-Quat, AQ-07 Nucleic Acid. Se realizó la PCR convencional con diferentes concentraciones de MgCl2 1 mM, 1,5 mM y 2.0 mM y a dos temperaturas de alineamiento: 60 °C y 55 °C. Los productos PCR se separaron por electroforesis en un gel de agarosa 1 % Las bandas se visualizaron en un fotodocumentador. La sensibilidad se calculó teniendo en cuenta el número de bacterias en diferentes diluciones. Resultados: Se obtuvo una concentración 1,55x106 ng/ul de DNA genómico a partir de una suspensión bacteriana de 108 células bacterianas/ml, con índice de pureza 1,648 (relación de OD260/OD280). Los mejores resultados se obtuvieron con una concentración de 2 mM de MgCl2 y una temperatura de alineación de 55°C. En cuanto a la sensibilidad se obtuvo un límite de detección de 5 x 10 / 5 µL células bacterianas en suspensión. Conclusión. En la prueba de PCR convencional para Porphyromonas gingivalis ATCC 33277, las condiciones óptimas de estandarizacion son la concentración de 2 mM de MgCl y temperatura de alineación 55°C y es necesario una carga bacteriana mínima de 5 x 10 células/5 ul como límite de detección.

The objective of the present work was to standardize and optimize the conventional PCR technique for detection of Porphyromonas gingivalis ATCC 33277. Material and methods: P. gingivalis strain ATCC33227 was planted on Bruella agar enriched with sheep's blood supplemented with hemin and Vitamin K DNA was extracted using the protocol using cetyl trimethylammonium bromide (CTAB). The quantity and quality of the genetic material obtained with the UV Ampli-Quat photometer, AQ-07 Nucleic Acid. Conventional PCR was performed with different concentrations of 1 mM MgCl 2, 1.5 mM and 2.0 mM and at two alignment temperatures: 60°C and 55°C. PCR products were separated by electrophoresis on a 1% agarose gel. The bands were visualized in a photodocumentator. Sensitivity was calculated by taking into account the number of bacteria in different dilutions. Results: A concentration of 1.55x106 ng / ul genomic DNA was obtained from a bacterial suspension of 108 bacterial cells / ml, with purity index 1.648 (OD260 / OD280 ratio). The best results were obtained with a concentration of 2 mM MgCl2 and an alignment temperature of 55°C. Regarding sensitivity, a limit of detection of 5 x 10/5 μL bacterial cells in suspension was obtained. Conclusion: In the standard PCR test for Porphyromonas gingivalis ATCC 33277 the optimum standardization conditions are the concentration of 2 mM MgCl and 55°C and a minimum bacterial load of 5 x 10 cells / 5 ul as detection limit is required.