Two-stage screening of combinatorial peptide libraries: Application to bovine serum albumin ligand selection

Abstract

Los péptidos cortos son excelentes ligandos para cromatografía de afinidad. El método dividir-acoplar-recombinar permite obtener bibliotecas peptídicas con todas las combinaciones de los aminoácidos en la forma de “una bolilla-un péptido”. En este trabajo, se diseñó un método de doble screening de bibliotecas para seleccionar ligandos peptídicos. El primer screening de la biblioteca se realizó con la proteína blanco (seroalbúmina bovina, BSA) marcada con Texas Red. Las bolillas fluorescentes se aislaron en forma automática utilizando el equipo Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS). Las bolillas aisladas se lavaron y sometieron a un segundo screening realizado con BSA marcada con biotina y con estreptavidina-peroxidasa y las bolillas se revelaron con 3,3'-diaminobencidina. Los péptidos presentes en las bolillas aisladas se secuenciaron por espectrometría de masas. Se sintetizaron los péptidos obtenidos con mayor frecuencia y se acoplaron a agarosa. Las matrices adsorbieron la BSA y no adsorbieron el Texas-Red ni la estreptavidina-peroxidasa. La BSA es el principal contaminante en los sobrenadantes de cultivo cuando se produce rhEPO en células CHO. Con la intención de utilizar estas matrices para la remoción de la BSA de dichos sobrenadantes, se ensayó además, la adsorción de rhEPO pura a las matrices, la cual no fue retenida en ninguno de los casos.

Short peptides are excellent ligands for affinity chromatrography. Divide-couplerecombine method allows obtaining a peptide library with all possible combinations of the amino acids in the form of "one bead-one peptide". It was designed a two-stage library screening method for peptide ligands selection in this work. The library screening was performed with the target protein (bovine seroalbumin, BSA) coupled to Texas Red. Fluorescent beads were automatically isolated using the Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS) equipment. Isolated beads were washed. The second screening was performed with BSA coupled to biotin and with streptavidin-peroxidase and revealed with 3,3'-diaminobenzidine. Peptides from isolated beads were sequenced using a mass spectrometry analyzer. Those peptides appearing with more frequency were synthesized and immobilized on agarose. All peptides adsorbed BSA but not Texas-Red nor streptavidin-peroxidase. As BSA from fetal bovine serum is the main contaminant, when expressing rhEPO in CHO cell culture, it was studied rhEPO adsorption on these matrices for their future application in BSA removal from cell cultures. When a pure sample of rhEPO was loaded on peptide-agarose columns, all rhEPO passed through.