Immunocytochemical and morphological effects of short­term stimulation of cultured astrocytes

Abstract

Se recurrió al análisis de imagen a nivel de microscopía óptica y a la caracterización ultraestructural por microscopía electrónica de transmisión, para evaluar la diferenciación celular en jóvenes cultivos astrocitarios de ratón expuestos a dBcAMP durante 1 día. Los astrocitos diferenciados, así definidos por la tinción de GFAP mediante estreptavidina-peroxidasa, doblaron su número (45%) con respecto a los controles (23%). Además, y a expensas de las células inmaduras poligonales carentes de prolongaciones, se registró un aumento significativo de astrocitos elongados y ramificados. No se observaron cambios apreciables en el perímetro celular, pero sí en el área celular, ya que la superficie inmunomarcada estaba significativamente reducida. Concomitantemente, la microscopía electrónica visualizó en el citoplasma a numerosos filamentos intermedios de distribución radial y de características compatibles con GFAP, lo que contrastaba con su escasez y menor organización en los cultivos controles. Si bien la reconocida plasticidad evidenciada por el astrocito ante las diversas condiciones de cultivo impone cautela en su empleo como contraparte de la célula reactiva in vivo, los cultivos astrocitarios activados representan una herramienta valiosa para la discriminación de factores inherentes a la respuesta del SNC a la injuria. Cabe concluir que en un modelo experimental de astrocitos activados pero carentes de los efectos agregados del envejecimiento celular, los presentes resultados han posibilitado una más precisa caracterización cuantitativa, ya que han permitido establecer que el porcentaje de células GFAP-positivas y la medida del área celular son adecuados parámetros de la temprana diferenciación inmunocitoquímica y morfológica, respectivamente.

Both image analysis at light microscopy level and ultrastructural characterization by transmission electron microscopy were employed to evaluate the differentiation stage in young cultured mouse astrocytes after 1-day exposure to dBcAMP, a chemical compound known to induce cell activation. The aim was to validate an experimental model of stimulated astrocytes preserving the properties of recently seeded cells, thus avoiding the overlapping effects of in vitro aging. Differentiated astrocytes, as evidenced by GFAP labeling by streptavidinperoxidase, doubled their number in treated cultures (45%) versus controls (23%). In addition, a significant increase in process-bearing astrocytes (elongated and ramified forms) to the detriment of immature polygonal astrocytes, was recorded. No noticeable changes were found in cell perimeter, but cell area displayed a significant reduction in labeled surface of astrocytes undergoing morphological differentiation. Concomitantly, electron microscopy showed that radially organized bundles of numerous intermediate filaments compatible with GFAP replaced the few scattered structures observed in control cultures. However, methodological caution is advisable as regards the relevance of this in vitro counterpart of in situ reactive astrocytes, since cell plasticity is recognized to depend on culture conditions. At any rate, present quantitative results demonstrate that GFAP-positive cell percentage and cell area measurement are adequate parameters of early immunocytochemical and morphological differentiation, respectively, and thus contribute to a better histometric characterization of an easily available substrate to discriminate the wide variety of factors involved in CNS response to injury.