Uso del inmunoblot (Western blot) en el laboratorio clínico para la detección de distrofina, disferlina y calpaína 3: tres proteínas de relevancia en el diagnóstico de miopatías hereditarias

Abstract

La ausencia y/o disfunción de 3 proteínas constitutivas del músculo, distrofina(UniProtKB - P11532) en el caso de las distrofinopatías y, disferlina(UniProtKB - O75923) y calpaína 3 (UniProtKB - P20807) en las distrofias de cadera, juegan un papel central en la etiología de estas miopatías hereditarias. La confirmación de su presencia o ausencia en biopsias musculares es de relevancia diagnóstica y marca la necesidad de contar en el laboratorio clínico hospitalario con una técnica sensible y específica, que permita la detección e identificación de estas tres proteínas en nuestros pacientes. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo de inmunoblot(Western blot, WB) adaptable al laboratorio de análisis clínicos hospitalario, para la detección de 3 proteínas constitutivas del músculo (distrofina, disferlina y calpaína 3) en material extraído de biopsias de pacientes. Aproximadamente 20 - 40 mg de biopsia muscular fue desnaturalizada en presencia de detergente SDS y mercaptoetanol por 10 minutos a 100° C y, posteriormente, analizadas en PAGE / SDS en formato mini-gel seguido de transferencia a membranas de nitrocelulosa e incubación con anticuerpos monoclonales(MAbs) con reactividad específica para las tres proteínas musculares mencionadas y revelado cromogénico y/o quimiolumínico. El protocolo presentado permite el análisis de un amplio rango de pesos moleculares que incluye a las 3 proteínas de interés: distrofina(430 Kd), disferlina (250 Kd) y calpaína 3 (95 Kd). La detección e identificación está basada tanto en la determinación del peso molecular relativo como en la reacción unívoca con anticuerpos monoclonales específicos. En el caso de calpaína 3 la técnica es capaz de detectar e identificar fragmentos de auto procesamiento en el rango de 55 - 60 Kd, un dato indicativo, no sólo de la presencia y expresión del respectivo gen, sino también de la funcionalidad de su producto. Se discute la conveniencia de utilizar quimioluminiscencia o cromógenos en el revelado del WB.

The absence and/or dysfunction of three constitutive human muscle proteins: dystrophin (UniProtKB - P11532) in the case of dystrophinopathies, and calpain 3 and dysferlin (UniProtKB - P20807 and UniProtKB - O75923, respectively), in limb-girdle muscular dystrophies or LGMD, play a key role in the etiology of these hereditary myopathies. Confirming their presence or absence in muscular biopsies is essential for a correct diagnosis of the disease and underlines the need for a sensitive and specific technique to detect these proteins in the clinical laboratory. To develop a Western blot protocol to be used in the clinical laboratory for the detection and identification of dystrophin, dysferlin and calpain 3 in muscle biopsies. Approximately 20 - 50 mg of muscular biopsies in Urea and SDS containing buffer were analyzed in PAGE/SDS minigels, followed by electrotransference to nitrocellulose membranes, incubation with monoclonal antibodies (MAbs) specific for each of the three mentioned proteins and development with either chromogenic or chemiluminescence reagents. We showed a protocol suitable for the analysis of the large molecular-weight proteins dystrophin (430 Kd), dysferlin (220 Kd) and calpain 3 (95 Kd). Identification was based on both the analysis of their molecular weight and the univocal reactivity with specific monoclonal antibodies (MAbs). In the case of calpain 3, the technique detects not only the 95 Kd complete gene product, but also extra polypeptides in the 55 - 60 Kd range, indicative of a functional protease. The convenience of either the chromogenic or chemiluminescence protocol for signal development is discussed.