Caracterización de una enzima de tipo tripsina aislada de ciegos piloricos de Pygocentrus nattereri (Palometa) y su uso para la hidrolisis de colágeno

Abstract

La industria pesquera genera gran cantidad de desechos, como piel y vísceras; esta última es fuente importante de proteasas, como la tripsina. Esta serinoproteasa exhibe alta actividad en un amplio rango de pH y temperaturas, propiedad que la vuelve apta para aplicaciones industriales, e.g. producción de proteínas hidrolizadas. El nordeste argentino tiene gran variedad de especies de peces, entre ellas Pygocentrus nattereri (n.v palometa), pez de agua dulce con dieta carnívora y hábitos voraces, por lo que sus vísceras son rica fuente de proteasas. El objetivo fue aislar esta proteasa alcalina de las vísceras de palometa para caracterizarla y evaluar su actividad hidrolítica sobre colágeno de piel de la misma especie. Los ciegos pilóricos se trituraron y homogeneizaron con buffer Tris-HCl 50 mM pH 7.8, se sonicaron, centrifugaron y el sobrenadante se sometió a cromatografía de afinidad (Benzamidina-Sefarosa), eluyendo con ácido acético 25 mM a pH 4.5 y 3.2. La concentración proteica se evaluó por Abs 280nm y la actividad específica sobre BApNA-10 mM, verificando pureza mediante SDS-PAGE. El efecto del pH (2-14) y la temperatura (0-100 grados C) se determinó sobre azocaseína (5 mg/ml). Inhibidores de proteasas (TBSI, PMSF y EDTA-Na2) se ensayaron sobre BApNA. La actividad proteolítica sobre colágeno de palometa extraído por tratamiento ácido se evaluó a 0.5, 1, 2, 3 y 24 h, deteniendo la reacción por calor (5 min a 100 grados C). La escisión del colágeno se analizó por SDS-PAGE. La enzima purificada presentó masa molecular de 30 kDa, óptimos de actividad a pH 8.0-10.0 y Ta de 60 grados C. El EDTA no afectó su actividad, fue parcialmente inhibida por PMSF y completamente por SBTI. El análisis SDS-PAGE mostró que la enzima degrada completamente las cadenas alfa del colágeno de piel de palometa. Estos resultados sugieren que esta enzima tipo tripsina presente en el extracto de vísceras de Pygocentrus nattereri exhibe propiedades químicas y cinéticas (actividad optima a altos pH y temperaturas, capacidad de hidrolizar colágeno) que la vuelven un atractivo candidato para aplicaciones industriales.