Extracción de ADN adecuado para realizar análisis genómicos a partir de coágulos sanguíneos bovinos congelados

Abstract

Las muestras de sangre utilizadas en estudios serológicos dejan como remanente un coágulo, que generalmente suele ser descartado. Sin embargo, el mismo es una excelente fuente de ADN que puede ser utilizado en estudios genómicos, evitando muestreos adicionales. Además, permite ser conservado a -20°C hasta su procesamiento. Existen muchos kits comerciales para la extracción de ADN, pero son costosos y por lo tanto poco convenientes ante un alto número de muestras. Asimismo, algunos métodos tradicionales como el fenol-cloroformo resultan riesgosos por su toxicidad. Los antecedentes bibliográficos respecto a la estandarización de métodos caseros para extraer ADN de calidad y buen rendimiento a partir de coágulos de sangre congelados son muy escasos. Por ello, se justifica optimizar protocolos propios (in-house). Se describen dos variantes del clásico método de extracción Salting out, adaptado de Miller et al., (1988), evaluado respectivamente con un único buffer de lisis celular (Shaik et al., 2016) y con 3 buffers: (buffer de lisis de glóbulos rojos, buffer de lisis de glóbulos blancos y solución de digestión). Se realizó la extracción de ADN de 20 coágulos de sangre bovina previamente conservados a –20°C con un período de conservación de 7 meses. Los coágulos fueron degradados físicamente con un homogeneizador portátil (D-160, Dlab, dos pulsos de 10 segundos a 15000 rpm). El coágulo disgregado se distribuyó en 2 alícuotas (⁓500 μL), con el fin de procesar cada muestra con las dos variantes del método de extracción. Ambos tratamientos de lisis (uno o tres buffers) fueron seguidos de una incubación overnight con la enzima proteinasa K (Promega, 10 mg/mL) a 56°C. Luego se añadieron 250 μL de una solución saturada de cloruro de sodio (5M) y se centrifugó a 20000×g por 5 minutos para lograr la precipitación de la fase proteica. Finalmente se precipitó el ADN con la adición de 1000 μL de etanol absoluto (Biopack), seguido de una centrifugación a 20000×g de 2 minutos. Se repitió el mismo procedimiento con etanol 70% y una vez obtenido el pellet resultante correspondiente al ADN precipitado se dejó secar el microtubo sobre papel absorbente a temperatura ambiente hasta lograr la evaporación total del alcohol. Por último, se resuspendió el pellet en 100 μL buffer TE 1X (InbioHigway). Se cuantificó el rendimiento total (ng/μL) y la calidad (lectura A260/280nm) del ADN extraído con un espectrofotómetro (Epoch, BioTek). El valor esperable para ADN de buena calidad es de ⁓1,8- 2,0 (Lucena-Aguilar et al., 2016). La integridad del ADN extraído con ambos métodos se corroboró mediante electroforesis en geles de agarosa al 0,8%.En un segundo ensayo, se evaluó el efecto del período de conservación de muestras congeladas, utilizando solamente el método de extracción Salting out con la variante de tres buffers de lisis y un número mayor de muestras. Se realizó la extracción de ADN a partir de dos grupos de coágulos sanguíneos conservados a –20°C: un grupo (A) de 76 muestras con un período de conservación de 1 mes y el otro grupo (B) de 91 muestras con un período de conservación de 9 meses. En el caso del protocolo que utilizó un único buffer de lisis celular, el valor promedio del rendimiento fue 551,4 ng/μL (239,4 - 863,4) y la calidad fue 1,206 (1,072 - 1,339). Se evidenció una reducida lisis celular y, consecuentemente, una escasa precipitación de proteínas. De este modo, con este protocolo se logró cuantificar sólo el 35% de las muestras, siendo nula la disgregación del coágulo en el resto. En las muestras en las que fue posible la cuantificación, si bien el rendimiento pareciera óptimo, al observar el bajo valor de la lectura A260/280nm, sugiere un alto grado de contaminación con proteínas, afectando considerablemente la pureza del ADN extraído. El protocolo que utilizó tres buffers obtuvo un valor promedio de rendimiento de 188,0 ng/μL (128,5 - 247,4) y un valor promedio de calidad de 1,724 (1,680 - 1,766). Con este protocolo se logró cuantificar el rendimiento y calidad del procesamiento del 100% de las muestras. La electroforesis en geles de agarosa reveló la presencia de bandas nítidas y proporcionales al rendimiento de cada muestra, confirmando la obtención de ADN de buena integridad y alto peso molecular. En la prueba del efecto del período de conservación, la estimación promedio de calidad (lectura A260/280 nm) fue 1,816 (1,801 - 1,831) para el grupo A y 1,766 (1,743- 1,776) para el grupo B, respectivamente, mientras que el rendimiento promedio fue 271,3 ng/μL (231,4- 311,3) para el grupo A y 210,8 ng/μL (174,9- 246,6) para el grupo B, respectivamente. Se observó una diferencia estadísticamente significativa entre los grupos (p< 0,05) para ambas determinaciones. Estas diferencias indican que el período de almacenamiento tiene un impacto significativo en la calidad y rendimiento del ADN extraído, disminuyendo los valores cuanto mayor es el período. No obstante, a pesar de las diferencias registradas, los parámetros obtenidos garantizan un ADN de calidad adecuada.De acuerdo con la puesta a punto y caracterización de ADN extraído a partir de coágulos sanguíneos bovinos congelados previamente, se puede concluir que el método de extracción Salting out con la utilización de tres buffers de lisis celular, además de ser una opción económica, no tóxica y sencilla, garantiza ADN de calidad y rendimiento requeridos para la realización de estudios genómicos. También se debe tener en cuenta que la conservación prolongada de los coágulos a -20°C afecta negativamente el rendimiento y calidad del ADN; sin embargo, no fue una limitante en los períodos de conservación evaluados en este caso.