Actividad e inmunolocalización in situ de la LA H+-ATPasa Tipo V en branquias del camarón Palaemon argentinus (CRUSTACEA: DECAPODA) luego de una transferencia abrupta a salinidades concentradas

Abstract

Evaluamos la actividad enzimática de la H+-ATPasa tipo V (VHA) en branquias aisladas de adultos del camarón Palaemon. argentinus en agua dulce (1‰, T0: control) y transferidos abruptamente a salinidades concentradas (15 y 25‰) durante un plazo corto (6h); mediano (48h) y largo (>3 semanas). La inmunolocalización in situ y semi-cuantificación de la VHA se realizó en camarones mantenidos largo plazo en las 3 salinidades. Actividad enzimática: usamos sobrenadante (10000xg 30 seg) de homogenato de pool de branquias (sacarosa 0,25 M/EGTA-Tris 0,5 mM, pH 7,4). Medimos la hidrólisis de ATP (5 mM) en un medio de reacción: 1 mM NaN3, 1 mM Ortovanadato en 50 mM buffer Tris-HCl (pH 7,4) y en presencia/ausencia de 1µM de Bafilomisina A1. La actividad (nmoles Pi min-1 mg de prot1) se determinó como la diferencia entre ambos ensayos. Inmunolocalización: secciones transversales (4 μm) de branquias de adultos fijados en Bouin (n=3) se recogieron en portaobjetos recubiertos de poli-L-lisina, se revelaron los sitios antigénicos (citrato de sodio y microondas), y se sumergieron durante 10’ en Tween 20 al 0,01%, NaCl 150 mM, PBS 10 mM, pH 7,3. Tras tres lavados en PBS, los portaobjetos se incubaron 2h a temperatura ambiente en una cámara húmeda con una mezcla del anticuerpo primario policlonal de cobaya contra la VHA (1/100, SM-PBS 0,5%); se montaron en un medio antiblanqueo (Gel/Mount) y se observaron con un microscopio Zeiss Axioimager® equipado con un filtro fluorescencia (380-770 nm) y software AxioVision 4. Se utilizó ImageJ para analizar la inmunofluorescencia in situ. Las variaciones en la actividad específica se evaluaron con ANOVAs de una vía entre los tiempos de exposición y el test Holm-Sidak para las comparaciones a posteriori vs T0. Las variaciones en la inmunofluorescencia se testearon con ANOVA anidado mixto con individuo (factor aleatorio) anidado al tratamiento de salinidad, seguido del test SNK. La transferencia abrupta a 15‰ indujo cambios en la actividad específica (P< 0,002). Respecto del control (T0 = 1.604 ± 119,194 nmol Pi min-1 mg prot-1), la actividad VHA de las branquias disminuyó un 53% a las 48 h (P = 0,017) y un 44% tras la exposición a largo plazo (P = 0,025). Por el contrario, luego de la transferencia abrupta a 25‰ la actividad VHA no difirió de la condición control (P= 0,048). Se observó inmunotinción positiva para la VHA en las células pilares que, además, fue más alta en 15‰ (P = 0,015) a pesar de la variabilidad entre individuos (P< 0,0001). La mayor abundancia de proteína en conjunto con su menor actividad específica tras un largo plazo en 15‰, sugieren que la VHA podría estar modulada por la activación/inactivación de proteína preexistente. Además, los resultados indican que la VHA tendría un rol clave en el mantenimiento de la homeostasis en salinidades bajas e intermedias, pero no así en salinidades concentradas.