Estudio del polimorfismo del gen de TNF-α, de dicha citocina, y de MCP-1 en pacientes con queratopatía climática esferoidea

Abstract

Objetivo: Investigar polimorfismo de nucleótidos únicos (SNP) en la posición -308 (G/A) del gen TNF-α y la participación de las citocinas TNF-α y MCP-1 en pacientes con queratopatía climática esferoidea (QCE) y en controles sanos. Materiales y métodos: Participaron 15 pacientes con QCE y 15 individuos sanos del departamento El Cuy, Provincia de Río Negro. Todos ellos, luego de firmar el consentimiento informado, recibieron un examen oftalmológico completo y se recolectaron muestras de sangre y lágrima para realizar diferentes estudios. EL ADN genómico fue obtenido de sangre de todos los individuos mediante el método de salting out y posteriormente amplificado y estudiado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el sistema de amplificación refractaria a la mutación (ARMS). También se investigaron concentraciones de algunas citocinas proinflamatorias en lágrimas y en sobrenadante de cultivo de células epiteliales corneales humanas (CECH) tratadas o no con radiación ultravioleta B (RUV-B). Resultados: Los resultados de SNP en la posición -308 (G/A) del gen TNF-α (frecuencia alélica y genotípica) indicaron ausencia de diferencias significativas entre pacientes y controles sanos. Fenotípicamente ambos grupos de individuos serían bajos o intermedios productores in vitro de la citocina TNF-α. Sin embargo en las lágrimas de pacientes con QCE se detectaron concentraciones significativamente superiores de TNF-α, IL-1β y MCP-1 (citocinas proinflamatorias) que en lágrimas de individuos controles sanos (p<0,0001) En la periferia y limbo de la córnea las células dendríticas (CD) incrementaron significativamente con el progreso de la enfermedad (p<0,05). La contribución del epitelio corneal en el proceso infl amatorio fue investigada utilizando CECH expuestas o no a 10 mJ/cm2 de RUV-B. A pesar de la presencia de gelatinasas, IL-6 e IL-8 en sobrenadantes de cultivos obtenidos a las 48 horas (datos no mostrados) no observamos niveles detectables de TNF-α, IL-1β ni MCP-1. Conclusión: Este trabajo aporta nuevos datos para aumentar los conocimientos sobre los mecanismos inmunológicos involucrados en la etiopatogenia y progresión de la QCE. Demostramos que las citocinas proinflamatorias MCP-1 y TNF-α están significativamente elevadas en lágrimas de individuos con QCE, como se observó previamente con IL-1β. MCP-1 sería la responsable del aumento de CD en córnea periférica y limbo de estos pacientes a medida de que la enfermedad avanza. El hallazgo de que estas citocinas no pudieron ser detectadas en cultivos de CECH estresadas con RUV-B implica que otras células son las responsables de su producción o que además de RUV-B otros factores son necesarios para iniciar esta cascada de eventos que se observan en esta hipersensibilidad corneal humana.

Purpose: To investigate Single Nucleotide Polymorphism (SNP) at -308 position (G/A) of TNF-α gen and involving of TNF-α and MCP-1 cytokines in Climatic Droplet Keratopathy (CDK) patients and healthy controls. Materials and methods: Fifteen patients with CDK and fifteen healthy controls from departamento El Cuy, province of Rio Negro were involved in this study. After informed consent was obtained from all participants, they had a complete eye examination and then tear and blood samples were collected to perform different assays. DNA was obtained from blood of all individuals using the method of “salting out” and then amplified and studied performing the polymerase chain reaction (PCR) with Amplification-refractory Mutation System (ARMS). Furthermore, some cytokines concentrations were measured in tears and supernatants from human corneal epithelial cells (HCEs) exposed or not to UVR-B radiation. Results: Analysis from SNP at position -308 (G/A) of TNF-α gen (allelic and genotypic frequency) showed no significant differences between patients and healthy controls. Phenotypically both groups of individuals would be low or intermediate in vitro producers of TNF-α cytokine. However, in tears from CDK’s patients we detected significantly higher concentrations of TNF-α, IL-1β and MCP-1 (pro-infl ammatory cytokines) than in healthy control subjects tears (p<0.0001). At the corneal peripheral / limbus area, dendritic cells (DCs) increased significantly with the progression of the disease (p<0.05). The corneal epithelium contribution to the inflammatory process was investigated using HCEs exposed or not to 10 mJ/cm2 of UV radiation–B (UVR-B). Despite the presence of gelatinases, IL-6 and IL-8 in culture supernatants obtained after 48 hours (data not shown), detectable levels of TNF-α, IL-1β and MCP-1 were not detected. Conclusion: This study provides new insights to increase our knowledge about the immunological mechanisms involved in the etiopathogenesis and progression of CDK. We showed that pro-inflammatory cytokines MCP-1 y TNF-α were significantly increased in tears from CDK’s patients, as previously described with IL-1β. MCP-1 would be responsible for the increasing of DCs on the corneal peripheral / limbus area of these subjects as the disease progresses. The fact that these cytokines could not be detected in cultures of HCEs stressed with UVR-B implies that other cells are responsible for their production or, in addition to UVR-B, other factors are necessary to initiate the cascade of events observed in this human corneal hypersensitivity.