Neutralización de los efectos de la toxina Shiga in vitro e in vivo mediante el uso de anticuerpos de yema de huevo

Abstract

La Argentina presenta la mayor tasa de incidencia de Síndrome Urémico Hemolítico (SUH) a nivel mundial, con 500 casos anuales en niños menores de 5 años (1).La principal causa de la enfermedad se debe a la infección con Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC), productora de toxina Shiga. La presencia de la toxina Shiga tipo 2 (Stx2) y/o algunas de sus variantes está asociada con los casos más severos de la enfermedad. El bovino es considerado el reservorio más importante de la bacteria y el contagio en humanos se produce principalmente por el consumo de carnes y lácteos mal cocidos. En la actualidad, no existen estrategias específicas de prevención o tratamiento para evitar la infección por EHEC o sus complicaciones (2). El uso de anticuerpos, particularmente los anticuerpos IgY derivados de la yema de huevo, se presenta como una alternativa para estos fines, ya que ofrecen la ventaja de generarlos con un alto rendimiento y un bajo costo de producción. Objetivos Determinar la capacidad inmunogénica de la subunidad B de Stx2 en gallinas y observar si los anticuerpos IgY obtenidos de la yema de huevo neutralizan los efectos de la toxina Shiga tipo 2 (Stx2) in vitro e in vivo. Materiales y Métodos Se produjeron anticuerpos IgY anti-Stx2 mediante inmunización de gallinas ponedoras Lohmann Brown con la subunidad B recombinante de Stx2. Los anticuerpos fueron obtenidos de la yema de huevo mediante el método de dilución con agua y luego su capacidad neutralizante de Stx2 fue testeada in vitro, sobre monocapa de células Vero, e in vivo, por seroneutralización en ratones. Para el ensayo en células Vero, la toxina Stx2 (4 CD50) fue pre-incubada con diluciones seriadas de los anticuerpos durante 1 hora a 37°C. Posteriormente, se agregó a la monocapa de células y se incubó durante 48hs a 37°C bajo atmósfera de 5% CO2. Como controles se utilizaron la toxina sin anticuerpos y la toxina pre-incubada con suero pre-inmune. La viabilidad de las células Vero se determinó mediante tinción con cristal violeta y se midió la absorbancia a 490 nm. El porcentaje de neutralización se calculó utilizando la fórmula: DO (toxina + anticuerpo) – DO (toxina sin anticuerpo) / DO (sin toxina) – DO (toxina sin anticuerpo) x 100. Los resultados se expresaron como porcentaje de neutralización frente a la concentración de IgY total en µg/ml y corresponden al promedio de ensayos por triplicado. El ensayo de neutralización in vivo se realizó en ratones NIH (10-14g) que se alojaron en cajas individuales en un ambiente con ciclos de luz controlados, temperatura y humedad constantes. Los ratones se dividieron al azar en 2 grupos: el que recibió Stx2 con diferentes diluciones de IgY anti-Stx2B (n:4) y el que sólo recibió toxina (n:4). La toxina Stx2 (5 LD50) fue pre-incubada con las diluciones de IgY durante 1h a 37°C y luego inyectada vía intravenosa, al igual que los controles. Se realizaron además, dos controles negativos, uno con ratones que recibieron solución fisiológica y otro control sanitario con ratones que no fueron inyectados. Los ratones fueron monitoreados durante 4 días. Los resultados del grupo control fueron utilizados para confirmar la dosis de la toxina y para corregir los valores de anti-toxina obtenidos. Los títulos de anticuerpos se calcularon con el método de Spearman-Karber (3). Resultados Los anticuerpos IgY obtenidos de las gallinas inmunizadas con Stx2B, lograron neutralizar los efectos de la toxina Stx2 (4 CD50) en células Vero, siendo necesaria sólo una concentración de 4,28 µg/ml de IgY total. Los ratones que recibieron sólo toxina murieron al tercer día del experimento, mientras que los que recibieron toxina junto con una dilución menor o igual a (sería así, no?) 1/160 de IgY total, sobrevivieron. La actividad neutralizante, calculada por el método de Spearman-Karber como la dilución de anticuerpo que previene el 50% de la mortalidad en animales, resultó ser 1/640. El rendimiento de IgY total fue de 8,4 mg por huevo. Conclusiones Las gallinas son capaces de generar una respuesta inmune humoral contra la subunidad B de Stx2 y transferir esos anticuerpos a los huevos. Los anticuerpos IgY de yema de huevo lograron neutralizar la toxina Stx2 tanto in vitro como in vivo. Por lo tanto, estos anticuerpos se presentan como una alternativa económica y eficaz para el futuro desarrollo de terapias para la profilaxis o el tratamiento del SUH.