Steroid extraction: Get the best out of faecal samples

Abstract

Faecal steroid hormone metabolites are becoming increasingly popular as parameters for reproductive functions and stress. The extraction of the steroids from the faecal matrix represents the initial step before quantification can be performed. The steroid metabolites present in the faecal matrix are of varying polarity and composition, so selection of a proper extraction procedure is essential. There have been some studies to address this complex but often neglected point. Radiolabelled steroids (e.g. cortisol or progesterone) have frequently been added to faecal samples to estimate the efficiency of the extraction procedures used. However, native, unmetabolized steroids are normally not present in the faeces and therefore the results are artifi- cial and do not accurately reflect the actual recoveries of the substances of interest. In this respect, recovery experiments based on faecal samples from radiometabolism studies are more informative. In these samples, the metabolite content accurately reflects the mixture of metabolites present in the given species. As a result, it is possible to evaluate different extraction methods for use with faecal samples. We present studies on sheep, horses, pigs, hares and dogs that utilized samples containing naturally metabolized, 14C-labelled steroids. We recommend extracting faecal steroids by simply suspending the faeces in a high percentage of a primary alcohol (for glucocorticoid metabolites 80% aqueous methanol proved best suited for virtually all mammalian species tested so far). Not only does the procedure significantly increase the total amount of recovered radioactivity, it also increases the percentage of unconjugated metabolites, which are more likely to be recognized by the antibodies used in various immunoassays. The advantages of this extraction procedure are clear: it is very easy to use (no evaporation step is needed), it yields high recoveries and variation based on the extraction procedure is reduced to a minimum.Die Messung von Steroiden im Kot zur Erhebung von Reproduktionsstatus oder Belastungen wurde in letzter Zeit zusehends populär. Die Extraktion dieser Steroide aus dem Kot stellt dabei den ersten Schritt für eine Bestimmung dar. Die im Kot enthaltenen Steroidmetaboliten sind von wechselnder Polarität und Zusammensetzung, die Wahl der richtigen Extraktionsmethode ist daher entscheidend. Mittlerweile haben sich einige Studien mit dieser komplexen, aber weitgehend unbeachteten Thematik auseinandergesetzt. Dabei wurden oft radioaktiv markierte Steroidhormone (z.B. Kortisol oder Progesteron) dem abgesetzten Kot zugefügt, um die Extraktionseffizienz zu testen. Allerdings kommen die zugegebenen Steroidhormone in dieser, unveränderten Form im Kot nicht vor. Die Ergebnisse spiegeln daher nicht die tatsächliche Wieder- findungsrate wider. Diesbezüglich sind Experimente, die Kotproben aus Radiometabolismusstudien verwenden, wesentlich aufschlussreicher. In diesen Proben entsprechen die radioaktiven Metaboliten den tatsächlichen Steroidmetaboliten in der untersuchten Spezies. Die hier vorgestellten Studien, die solches Probenmaterial zur Evaluierung verschiedener Extraktionsmethoden von Steroiden in Kotproben von Schafen, Pferden, Schweinen, Hasen und Hunden einsetzten, enthalten somit die natürlich metabolisierten 14C-markierten Steroide. Basierend auf unseren Ergebnissen, empfehlen wir die Extraktion von Steroiden mittels simpler Suspension der Kotproben in einem hochprozentigen, einfachen Alkohol (für Glukokortikoidmetaboliten erwies sich 80%iges Methanol für alle getesteten Säugetierarten als am besten geeignet). Dadurch ließ sich nicht nur die Extraktionsausbeute deutlich steigern, sondern auch der Anteil an nicht konjugierten Metaboliten, die von den meisten verwendeten Antikörpern besser erkannt werden. Die Vorteile dieser Methode liegen auf der Hand: eine sehr leichte Handhabung (Eindampfen ist nicht erforderlich), eine hohe Extraktionsausbeute und eine hohe Präzision.