Análisis comparativo de métodos de extracción de ADN en semillas de algodón (Gossypium hirsutum)

Abstract

La extracción de ADN a partir de semillas de algodón presenta el desafío de evitar la coextracción de inhibidores de la reacción de PCR, naturalmente presentes en el tejido vegetal. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la eficacia de dos métodos de extracción de ADN en distintas fracciones de semillas de algodón (Gossypium hirsutum) utilizando un kit comercial como control. Se trabajó con tres tipos de semillas, las cuales fueron procesadas y se obtuvieron dos fracciones, una rica en cáscara y fibra (FRF) y la otra fracción rica en endospermo (FRE). Se realizó la extracción de ADN por triplicado mediante los siguientes métodos: precipitación salina con dodecil sulfato de sodio (SDS), precipitación con acetato de potasio (AK) y con kit comercial (KC, control). Se evaluó la concentración, pureza e integridad del ADN utilizando un espectrofotómetro y electroforesis en gel de agarosa. Los resultados sugieren que los métodos SDS y AK generan extracciones con mayor pureza y concentración que el KC, sin embargo en todos los métodos se observan contaminantes. No se observó degradación en ninguna de las muestras evaluadas. A su vez, se evaluó la actividad de la enzima taq Polimerasa en la amplificación de fragmentos de ADN mediante PCR. El 100% de las reacciones amplificaron en las muestras de ADN de la FRF obtenidas mediante SDS, y en ambas fracciones obtenidas por el método KC, sin diferencias en el tipo de semilla. La extracción de ADN con el método SDS sobre FRF de semillas de algodón constituye un método alternativo, más eficiente que el KC utilizado, ya que conduce a la obtención de ADN puro, en elevada concentración y de idéntica eficacia en la amplificación por PCR.

Plant tissue DNA extraction, in particular from seeds, requires revisions of techniques, in order to reduce co extraction of PCR inhibitors. The objective of the present work was to evaluate the efficacy of two economic methods of DNA extraction in different fractions of cotton seeds (Gossypium hirsutum) using a commercial kit as control. Three types of cotton seeds were ground separately to produce a fiber rich fraction (FRF), and an endosperm rich fraction (FRE). DNA extraction was carried out by triplicate following three methods: saline precipitation with sodium dodecyl sulfate (SDS), precipitation with potassium acetate (AK) and with a commercial kit (KC, control). DNA concentration, purity, and integrity were evaluated by spectrophotometry and agarose gel electrophoresis. The results suggest that SDS and AK methods yield higher purity, and higher concentration of DNA extracts than KC method, nevertheless contaminants were observed in all the samples. No degradation was observed in any of the evaluated samples. Activity of the enzyme Taq polymerase was evaluated by the polymerase chain reaction. All the PCR reactions amplified in the FRF DNA samples obtained by SDS, and in both fractions obtained by the KC method, without differences in seed type. The extraction of DNA with the SDS method on FRF from cotton seeds constitutes an alternative method, more efficient than the KC used, since it leads to obtaining pure DNA, in high concentration and with identical efficiency in PCR amplifications.