Inducción del ciclo lítico de bacteriofagos en aislamientos de de Escherichia coli verotoxigenico O157:H7 Y O145:H-

Abstract

Escherichia coli verotoxigénico (VTEC) es un patógeno emergente involucrado en cuadros de intoxicaciones alimentarias, causante de diarrea y severas enfermedades en el hombre. Su principal factor de virulencia son las verotoxinas (VT1 y VT2) que se encuentran codificadas en fagos temperados y son responsables de muchas de las características patológicas y de las complicaciones severas de la infección por VTEC. La expresión de VT está ligada al ciclo lítico del fago y su liberación depende de la lisis de la bacteria, ya que no poseen un mecanismo específico para su secreción. La inducción de los fagos VT además de influir sobre la patogenicidad de VTEC, puede contribuir a la diseminación de los mismos y al desarrollo de nuevos patotipos VTEC. El objetivo de este trabajo fue evaluar la inducción del ciclo lítico de bacteriófagos de distintos aislamientos VTEC a través de diferentes metodologías. Se estudiaron cepas VTEC autóctonas de los serotipos O157:H7 (4 cepas vt2 positivas) y O145:H- (2 cepas vt2-positivas y 2 cepas vt1-positivas). Se cultivaron en caldo LB a 37°C con agitación hasta una DO entre 0,2-0,3. Parte del cultivo se indujo con mitomicina C (50µg/ml). La lisis de los cultivos se monitoreó a través de la densidad óptica (DO) a 600 nm. A las 3 hs post-inducción se tomaron alícuotas de sobrenadantes de los cultivos y se procesaron para la detección de fagos por 2 métodos: titulación en doble capa de ágar y método de la gota. Los ensayos se realizaron por triplicado, utilizando la cepa VTEC EDL933 como control positivo. En todos los cultivos se observó efecto de la mitomicina C, ya que las DO determinadas en presencia de este agente inductor fueron menores que en los cultivos sin inducir. Las curvas de crecimiento/lisis mostraron que todos los aislamientos en presencia de mitomicina C alcanzaron un máximo de crecimiento a las 2 hs. post-inducción, con valores de DO cercanos a 2 a partir del cual se observó la lisis. Los cultivos en ausencia de mitomicina C alcanzaron valores máximos de DO cercanos a 4 que se mantuvieron durante el transcurso del experimento. En los ensayos de titulación se observaron placas de lisis nítidas con los sobrenadantes de la cepa control y sólo de uno de los aislamientos O157:H7 y 2 aislamientos O145:H- vt2-positivos, presentando todos un mayor título cuando correspondían a cultivos inducidos. En el método de la gota también se observaron placas de lisis con sobrenadantes de estos aislamientos, pero no en el caso de los otros aislamientos O157:H7, en los cuales se observó un efecto lítico que indicaría presencia de colicinas. No se observó efecto lítico sobre la cepa hospedadora con sobrenadantes de las 2 cepas O145:H- portadoras de vt1. En todos los aislamientos VTEC se observó lisis por efecto de la inducción con mitomicina C, con curvas de crecimiento/lisis semejantes tanto para aislamientos vt1 como vt2-positivos. Sin embargo, se hallaron diferencias en cuanto a la detección de fagos en los respectivos sobrenadantes. El comportamiento diferencial observado entre los distintos aislamientos sugiere que el estudio de la inducción lítica de fagos de VTEC requiere el empleo de varias metodologías.