Efecto del agregado de colesterol sobre el orden de la membrana y el volumen de agua osmóticamente activa del ovocito bovino

Abstract

La exposición de los ovocitos a soluciones anisotónicas durante la criopreservación produce estrés osmótico y cambios abruptos en el volumen celular. Por otra parte, el descenso de la temperatura genera alteraciones de la membrana celular consecuentes a cambios en su fluidez. Teniendo en cuenta el rol del colesterol como modulador del orden lipídico de la membrana, hemos modificado el nivel de colesterol de ovocitos bovinos para hacerlos más resistentes a la criopreservación. El objetivo de este estudio fue evaluar el estado biofísico de la membrana celular en ovocitos cargados (+col) o no (ctr) con colesterol y determinar si estas variaciones modifican el volumen celular y el volumen de agua osmóticamente activa del ovocito. Complejos ovocito-cumulus bovinos obtenidos de ovarios de frigorífico se cargaron con colesterol al final de la maduración in vitro por 45 min con 15 mM metil-β- ciclodextrina/colesterol. El estado biofísico de las membranas se evaluó post-maduración a temperaturas decrecientes (38,5°C a -15°C) mediante espectroscopía de fluorescencia usando la sonda Laurdan. Mediante modelado matemático de la respuesta osmótica y ensayos de exposición a soluciones de osmolalidad conocida, en ausencia de solutos permeables (ensayos de Boyle-van´t Hoff), se calculó el volumen de agua osmóticamente activa del ovocito a partir de imágenes registradas en condiciones iniciales y finales (10 min). Los perfiles de la polarización generalizada del Laurdan mostraron que los ovocitos +col tienen una membrana más fluida que los ctr a temperatura fisiológica. En el rango de los 20°C a los -5°C, los ovocitos +col mostraron un estado de la membrana más ordenado, mientras que entre los -5°C y los -15°C este efecto se revierte mostrando un estado más fluido que los ctr. En condiciones isotónicas, el volumen de los ovocitos no mostró diferencias significativas entre ambos grupos (ctr: V0 =0,70 ± 0,05 nL; +col: V0 =0,68 ± 0,06 nL; p=0,54). A partir de la exposición a soluciones de osmolalidad conocida (hipo-, iso- e hiperosmóticas), se determinó la fracción de volumen celular inactivo (b). Estas estimaciones permitieron calcular el volumen de agua osmóticamente activa (W=V0 (1 – b)). El agregado de colesterol no afectó el W del ovocito (ctr: W=0,46 ± 0,06 nL; +col: W=0,48 ± 0,07 nL; p=0,61). Si bien los ovocitos bovinos +col muestran una membrana más fluida a temperatura fisiológica, un efecto que puede darse cuando la composición de la membrana plasmática es originalmente muy ordenada, esto no afectó el volumen celular en condiciones isotónicas ni el volumen de agua osmóticamente activa de los ovocitos. Por otra parte, el agregado de colesterol aumentó la fluidez de la membrana a muy bajas temperaturas, un efecto buscado para prevenir el daño causado por la criopreservación.