Análisis preliminar de la apoptosis inducida por BoHV-4 en células endometriales bovinas en presencia de infección natural con VDVB

Abstract

Introducción. Los virus han evolucionado y la clave de su éxito ha sido la capacidad de evadir los sistemas de defensa de la célula huésped para garantizar replicación y proliferación. El virus de la diarrea viral bovina (VDVB) y el gammaherpesvirus bovino tipo 4 (BoHV-4) forman parte de los principales patógenos virales que infectan el útero del bovino siendo responsables de enormes pérdidas económicas. Las infecciones por BoHV-4 en el endometrio bovino generalmente se presentan en concomitancia con bacterias Gram negativas. No obstante, las coinfecciones con otros agentes virales, como el VDVB, también son comunes. El BoHV-4 posee dos genes antiapoptóticos (v-Flip y v-Bcl2) e induce la apoptosis de las células infectadas como finalización del ciclo de replicación viral. Resultados previos demostraron que la expresión génica y la replicación de BoHV-4 en células endometriales bovinas (CEB) se ve afectada por la infección natural con una cepa no citopática (NCP) del VDVB. El objetivo del presente trabajo fue evaluar cómo la infección natural en CEB con una cepa NCP de VDVB afecta la apoptosis inducida por BoHV-4 y lipopolisacárido bacteriano (LPS). Materiales y métodos. Virus: Cepa 07/435 de BoHV-4. Células: Cultivos primarios de CEB, según método propuesto por Tebaldi et al. (2016). Los cultivos se analizaron para distintos patógenos de la reproducción, siendo un cultivo positivo para el genotipo 1 del VDVB-1 (CEB+VDVB). Se evaluó apoptosis inducida por los tratamientos BoHV-4 y/o LPS en las CEB y CEB+VDVB a diferentes tiempos post infección (p.i.) (12, 24, 48 hs), mediante la expresión de los transcriptos antiapoptóticos (v-flip y v-Bcl2) por RT-PCR, y las nucleares con la tinción de DAPI, expresando los resultados como Índice Relativo de Apoptosis (IRA). Se realizó un análisis de varianza y comparaciones de medias, según la prueba de diferencia significativa, en aquellos factores de estudio en donde los efectos fueron significativos (α:0,05). Resultados. Los ensayos de apoptosis en CEB infectadas con BoHV4 (+/- LPS) en presencia o ausencia del VDVB mostraron ausencia de la expresión del gen para v-Bcl2, mientras que los transcriptos para el gen v-Flip se expresaron en todos los tratamientos. Cuando se estudió la muerte celular con DAPI, no se detectó interacción entre los tratamientos y los tiempos de lectura sobre el IRA para CEB+VDVB expuestas al BoVH4, a LPS y a BoHV-4+LPS; sin embargo, se observó interacción entre los niveles de tratamientos y los tiempos de medición sobre el IRA cuando las CEB fueron expuestas a BoVH4 y BoHV-4+LPS. Asimismo, se observó una diferencia significativa en los valores del IRA obtenidos solo a las 48hs en CEB expuestas a BoHV-4 y BoHV-4+LPS. Discusión y conclusión. Las células que expresan proteínas tipo v-Flip están protegidas de la apoptosis inducida por la activación de Fas y/o de otros receptores relacionados. Por otra parte, la expresión del gen antiapoptótico v-Bcl2 puede establecer infecciones persistentes evitando la muerte celular (apoptosis). La expresión del gen v-Flip y la ausencia de expresión del v-Bcl2, podrían sugerir que la infección por BoHV4 induciría la apoptosis en células endometriales mediante la vía de señalización mitocondrial. Sin embargo, serán necesarios posteriores estudios para comprender mejor la vía apoptótica involucrada en los cultivos primarios de CEB en presencia de una coinfección viral. A su vez, los valores obtenidos y la independencia del tiempo de infección sobre el IRA en presencia del VDVB podría estar relacionado con la estrategia de las cepas NCP-VDVB de evitar la inducción de la muerte celular. Por lo tanto, la apoptosis inducida por BoHV-4 en células permisivas puede verse alterada en células primariamente infectadas con VDVB. Este hallazgo podría estar indicando cambios en las vías de señalización y consecuencias significativas en los procesos de muerte celular in vivo, como las coinfecciones y persistencia del virus en sus hospedadores naturales.