Aproximación proteómica para el estudio del metabolismo de los polihidroxialcanoatos en distintas condiciones de cultivo en pseudomonas extremaustralis: efecto de la relación c/n y la aireación

Abstract

Los polihidroxialcanoatos(PHA) son polímeros de reserva de interés como plásticos biodegradables. Según el monómero que los compone se clasifican en PHA de cadena corta (PHAcc:C3-C5) y de cadena media (PHAcm:C6-C16).Pseudomonas extremaustralis puede sintetizar PHAcc, particularmente polihidroxibutirato (PHB), y PHAcm. El objetivo del trabajo consistió en el análisis del efecto de la relación C/N y de distintas condiciones de aireación en el metabolismo de los PHA en P. extremaustralis mediante un enfoque proteómico. Los cultivos se realizaron en medio LBy 0.5NE2,que favorece la acumulación de PHA, suplementados con octanoato de sodio (O) con relaciones C/N de 3,7 (LB), 4,5 (LBO)y 8,5 (NEO), en distintas fases de crecimiento (exponencial vs. estacionaria) y condiciones de aireación (aerobiosis vs. microaerobiosis).Las células se cosecharon y se sonicaron. Los extractos proteicos se sembraron en geles de poliacrilamida y las proteínas totales se analizaron en un nanoHPLC acoplado a un espectrómetro de masa EASY-nLC 1000 en el CEQUIBIEM (FCEN-UBA).Las proteínas con expresión diferencial se determinaron utilizando el programa Perseus y otras herramientas informáticas. Se compararon los perfiles proteicos en varias condiciones: 1. LBO vs. NEO, fase estacionaria, aerobiosis; 2. NEO,fase exponencial vs estacionaria, aerobiosis; 3. NEO, fase estacionaria, aerobiosis vs. microaerobiosis y 4. LBO vs LB, fase estacionaria, aerobiosis. La producción de PHA se cuantificó por cromatografía gaseosa previa metanólisis. Se identificaron entre 1.100 y 1.350 proteínas. El análisis de la expresión diferencial entre condiciones permitió detectar cambios en proteínas involucradas en el metabolismo de los PHA y otras vías relacionadas. Se identificaron alrededor de 200 proteínas con expresión diferencial (sobre-expresadas+reprimidas) en todas las condiciones. En la condición1 entre las significativamente sobre-expresadas en LBO,se destacanlasintasa de PHB (PhbC),la acetil-CoAacetiltransferasay la 3-cetoacil-ACP reductasa mientras que las proteínas asociadas a la síntesis de los PHAcm se encontraron reprimidas en LBO. En la condición 2,en fase exponencial no se detectaron proteínas relacionadas con la síntesis de PHA. En la condición 3 en aerobiosis se encontraron diferencialmente sobre-expresadas PhbX, PhaP,PhaF relacionadas con la síntesis de PHAcc, además de una enoilacil-reductasa. En la condición 4 se encontraron sobre-expresadas en LBO a PhbX, PhbC,Pta, como también la 3-cetoacil-CoA tiolasay la PhaP. El aumento en la relación C/N incrementó la expresión de las proteínas involucradas en la producción de PHAcm. Los niveles de expresión fueron mayores en fase de crecimiento estacionario y aerobiosis para ambos tipos de polímeros. Se observaron pocas proteínas relacionadas con la producción de PHA en microaerobiosis respecto de aerobiosis.