Las células gliales de Müller permiten conservar neuroblastos luego de varios pasajes e inducen su diferenciación en fotorreceptores funcionales

Abstract

OBJETIVOS: Las células gliales de Müller (CGM) son actualmente consideradas stem cells en retina, con la potencialidad de reemplazar neuronas perdidas en enfermedades neurodegenerativas. Previamente establecimos que los neuroblastos (NB) en co-cultivo con CGM preservan su estado proliferativo, pueden ser re-sembrados y eventualmente comenzar su diferenciación en fotorreceptores (FRs). Investigamos ahora si la interacción con CGM permite conservar NB con características de stem cells luego de varios pasajes, y si es posible diferenciarlos luego en FRs maduros. MÉTODOS: Co-cultivos neuro-gliales de retina de rata se sembraron en medio con suero por 7 días, tras lo cual fueron repicados una o varias veces para generar co-cultivos secundarios o los correspondientes pasajes. Los NB se identificaron por morfología, expresión de Pax6 y Nestina y por incorporación de 5-bromo-deoxiuridina (BrdU), mediante inmunocitoquímica y citometría de flujo. La diferenciación de los NB en FRs se determinó por la expresión de opsina, Crx y periferina. La funcionalidad de los FRs se evaluó mediante la cuantificación de cGMP luego de la exposición a la luz. RESULTADOS: Mediante citometría de flujo e inmunocitoquímica se determinó que el 5% de las células redondas y pequeñas presentes en co –cultivos secundarios expresaron marcadores de stem cells (incorporación de BrdU, expresión de Nestina y Pax6), expresión que conservaron aún luego de cuatro pasajes. Las CGM indujeron la diferenciación de los NB en FRs maduros y funcionales, los cuales expresaron opsina y periferina y respondieron a la luz disminuyendo sus valores de cGMP. CONCLUSIONES: Nuestros resultados sugieren que las CGM generan y/o mantienen NB proliferativos y con características de stem cells luego de varios pasajes, y que luego los instruyen a iniciar su diferenciación y desarrollarse hasta convertirse en FRs funcionales.