Puesta a punto de ensayos de adherencia, internalización y sobrevida en aislamientos bovinos de Streptococcus agalactiae

Abstract

Streptococcus agalactiae es uno de los patógenos más frecuentemente asociado con mastitis bovina. Esta bacteria puede colonizar el epitelio mamario y producir factores de virulencia que afectan la función fisiológica de las células epiteliales, implicados en la invasión, la adhesión y la respuesta inmunitaria. Considerando que en la patogenia de la infección por S. agalactiae existen dos pasos críticos, que son la adhesión y la invasión de las células huésped, y dado que no hay estudios que caracterizan estos procesos, el objetivo fue poner a punto las técnicas para estudiar la interacción S. agalactiae-célula epitelial mamaria para luego, proponer terapias para impedir o mitigar la infección por S. agalactiae.Se analizaron dos cepas de S. agalactiae aisladas de vacas lecheras con mastitis de la Cuenca Mar y Sierras (B49 y B63). Se utilizó la línea celular bovina de células alveolares mamarias (MAC-T). En el caso de los ensayos de adherencia, en una placa de 96 pocillos se co-cultivó durante 2 h una suspensión bacteriana con una monocapa confluente de células MAC-T en DMEM a una multiplicidad de infección (MOI) de 10:1 Posteriormente, se descartó el medio de cultivo de la placa y se realizaron lavados con PBS. Se lisaron las células con Triton X-100 (0,025% v/v) para liberar bacterias intracelulares. Se realizaron diluciones seriadas, se sembraron por triplicado en placas de TSA y se incubaron a 37 ºC durante 24 h para determinar las UFC por pocillo. En el caso de los ensayos de internalización, el co-cultivo se trató con gentamicina (100 μg/ml) en DMEM a 37°C2 durante 2 h para eliminar las bacterias extracelulares. Antes de descartar los sobrenadantes, alícuotas de 5 μL del mismo se sembraron en placas con TSA y se incubaron a 37 ºC durante 24 h para comprobar la efectividad del tratamiento con gentamicina. Las monocapas se lavaron con PBS y se lisaron con Triton X-100. Los lisados se diluyeron serialmente 10 veces, se sembraron por triplicado en TSA y se incubaron overnight a 37°C. Para el ensayo de sobrevida, el co-cultivo se trató con gentamicina 0,01 mg/mL.Los resultados obtenidos muestran que la cepa B63 se adhiere, pero no internaliza en las células MAC-T, mientras que la cepa B49 se adhiere e internaliza en las células epiteliales mamarias y, además, sobrevive en las mismas luego de 24 h de incubación.La puesta a punto del ensayo resultó exitosa y, mostró diversidad en cuanto a la capacidad de S. agalactiae de internalizar y sobrevivir en tejido mamario. Las cepas utilizadas para los ensayos fueron obtenidas de diferentes tambos y presentaban distintos serotipos, perfiles de virulencia y resistencia a antibióticos. A pesar de que las cepas ensayadas fueron sólo dos, los resultados muestran que distintas cepas de este patógeno pueden interaccionar de diferente manera con las células epiteliales del hospedador, lo que pone en evidencia la importancia de estudiar los factores de virulencia involucrados.