Desarrollo de nuevo medio de cultivo diferencial para la identificación de cepas de Bifidobacterias

Abstract

Se ha demostrado que el uso de Bifidobacterias contribuye a mejorar la salud del huesped. Principalmente, previenen infecciones gastrointestinales, regulan el sistema inmune, mejoran las capacidades metabólicas intestinales, mantienen el balance de la microbiota y la inmunidad del huésped. Tomando en cuenta estos efectos positivos se propuso el desarrollo de un medio de cultivo diferencial que permita el recuento de cepas del género Bifidobacterium. Para el recuento de bifidobacterias se elaboró un medio de cultivo que denominamos “medio para Bifidobacterium modificado” (MBM). Preparación de “medio para Bifidobacterium modificado” (MBM). Ingredientes para 1l: Medio Lactobacilli Agar AOAC 24g, Agar Diferencial para Clostridios 21g,Verde de bromocresol en solución de Na(OH) 20ml, Cloruro de litio 2,5g, Ácido propiónico al 5% en agua destilada 25ml, Agar-agar 4,4g, Agua destilada 950ml. Se preparó agregando Medio Lactobacilli Agar AOAC, Agar Diferencial para Clostridios, verde de bromocresol, cloruro de litio, agar-agar y agua destilada. Se fundió y autoclavó a 121ºC durante 15 minutos. Se dejó enfriar a 50-55ºC, se ajustó a pH 5-5,5 con el agregado del ácido propiónico previamente esterilizado mediante filtración. El crecimiento en el medio MBM fue controlado mediante el cultivo de una cepa comercial Bifidobacterium animalis BLC1 (Lyofast), observando colonias pequeñas, redondas, color verde oscuro y de borde neto, confirmando el crecimiento de la cepa control. Para demostrar la selectividad del medio MBM, se realizó la siembra de cepa de referencia STEC O157 EDL933. No se observó crecimiento de la misma en el medio estudiado. Además, se realizó la siembra de dos cepas comerciales de lactobacilos: Lactobacillus acidophillus (LA3) y Lactobacillus ramnosus (LB21) (ambos Lyofast), obteniendo morfología de colonia diferente, redonda, irregular y grande (2mm) color amarillo con el centro verde y a la coloración se observaron bacilos G(+). Luego, para comprobar la selectividad del medio para crecimiento y desarrollo únicamente de cepas del género Bifidobacterium, se trabajó con un grupo de n=8 lechones neonatos clínicamente sanos, provenientes de n=8 cerdas libres de antibióticos. Luego de 12h de lactancia, los animales fueron sacrificados (siguiendo las normas éticas aprobadas por el Comité de Bienestar Animal de la FCV, UNCPBA) y se recolectaron muestras del contenido intestinal. Las mismas, se sembraron en medio MBM, las colonias con morfología de bifidobacteria se purificaron, se identificaron fenotipicamente, se realizó tinción de Gram y pruebas de catalasa y oxidasa. Una cepa pura compatible con Bifidobacterium, fue crioconservada en caldo MRS con cisteina (0.5%) y glicerol (17%) y liofilizada en medio con Leche-Lactosa. Se caracterizó por PCR (resultado positivo), y se secuenció en el Laboratorio de Alimentos Stamboulian confirmando resultado 100% de compatibilidad para Bifidobacterium animalis subsp. lactis. Finalmente, podemos concluir que este medio diferencial nos permitió reconocer colonias compatibles con Bifidobacterias y la cepa aislada será utilizada en futuros ensayos para evaluar su capacidad probiótica y posible utilización en alimentos funcionales.