Primeros pasos en la secuenciación y el análisis genómico del virus de Epstein Barr

Abstract

El virus de Epstein Barr (EBV) es el agente etiológico de la mononucleosis infecciosas y se asocia a patologías malignas linfoides o epiteliales. Existen 2 tipos, EBV1 y EBV2, que se diferencian por polimorfismos en los genes de latencia EBNA2 y EBNA3A, 3B y 3C. Nuestro grupo de trabajo ha caracterizado la variación de EBV a nivel genético. Sin embargo, con el advenimiento de las nuevas tecnologías de secuenciación masiva (NGS), se ha comenzado a nivel mundial a estudiar el genoma completo de EBV. Se han secuenciado más de 200 genomas completos de diversas regiones del mundo; no obstante, nuestra región geográfica está subrepresentada.Se incluyeron 16 muestras de pacientes pediátricos con patologías asociadas a EBV con carga viral mayor a 106 copias/ug de ADN. Las librerías de secuenciación se construyeron con el equipo SureSelect QXT Target Enrichment, basado en la hibridación y captura del genoma vira con sondas especificas diseñadas con la plataforma SureDesign, a fin de enriquecer su proporción respecto del ADN humano. Luego se secuenciaron en el equipo NexSeq 500. Para el análisis bioinformático, se desarrolló un pipeline automatizado que incluyó el pre-procesamiento de las lecturas, mapeo contra los genomas de referencia de EBV1 y EBV2, llamado de variantes y obtención de las secuencias consenso.Se realizó la tipificación viral mediante amplificación de una región polimórfica de EBNA-3C por PCR. Se obtuvieron 15 genomas completos. El análisis bioinformático sobre el gen EBNA2 y la familia de EBNA3 permitió realizar la tipificación viral, identificando 9 aislamientos con EBV1 y 6 con EVB2. El análisis de componentes principales y la reconstrucción filogenética de genomas completos avalaron este resultado, que luego se validó mediante la tipificación de las muestras por PCR. A partir del análisis discriminante de componentes principales, se identificaron dos clusters dentro de la población de EBV1, que difieren en los BLLF2-BLLF3 Actualmente, se está estudiando la segregación de las secuencias obtenidas respecto a las de otras regiones geográficas.Se obtuvieron los primeros 15 genomas completos de EBV de muestras locales secuenciados y analizados en Argentina. El estudio bioinformático sobre los genes EBNA2 y EBNA3A, 3B y 3C, resultó adecuado para lograr la correcta tipificación viral dado que presentó resultados concordantes con la PCR cualitativa sobre el gen EBNA3C. El análisis discriminante de componentes principales nos permitió identificar distintos clusters dentro de la población EBV1 lo cual sugiere que la clasificación en EBV1 y EBV2 no refleja la completa variabilidad del el genoma viral. Además haciendo uso de las herramientas bioinformáticas, se lograron poner en evidencia de forma rápida y precisa las diferencias entre los grupos observados.Finalmente, cabe destacar que este trabajo contribuyó a incrementar el número de genomas virales completos de nuestra región geográfica.