Different staining techniques evaluation for the study of sperm morphology and morphometry in bats (Mammalia: Chiroptera)

Abstract

El estudio de la morfología espermática implica el empleo de diversas técnicas de tinción que permiten la visualización de las diferentes estructuras del espermatozoide y su variabilidad. Cada técnica varía en función de los colorantes empleados y los pasos necesarios para su ejecución. El objetivo de este trabajo fue evaluar distintas técnicas de tinción para el análisis de la morfología y la morfometría espermática en murciélagos. Se recolectaron muestras de epidídimo de 57 ejemplares adultos, que fueron maceradas en solución de Farmer y utilizadas para preparar frotis. Los extendidos fueron coloreados con Azul de Toluidina, Giemsa, May Grünwald-Giemsa, GRAM, Hematoxilina-Eosina, DAPI (4’,6-diamino-2-fenilindol), Fucsina Básica y Verde Jano. Los criterios para la comparación de las técnicas fueron: complejidad, tiempo requerido y costos asociados. Para el análisis morfométrico se tomaron microfotografías al microscopio óptico y de epifluorescencia y se midieron 50 espermatozoides por individuo. Solo se obtuvieron espermatozoides de 16 especímenes: Artibeus planirostris (n=5), Sturnira erythromos (n=3), Molossus molossus (n=4), Molossops temminckii (n=2), Histiotus laephotis (n=1) y Myotis albescens (n=1). Entre las técnicas evaluadas, el Azul de Toluidina demostró ser una técnica rápida, sencilla y de bajo costo para determinar la presencia de espermatozoides y describir su morfología general. Las tinciones dicrómicas como Hematoxilina-Eosina y May Grünwald-Giemsa fueron más eficientes en la diferenciación del núcleo y el acrosoma, aunque también resultaron más complejas y costosas en su realización. En conclusión, recomendamos el uso de las tres técnicas mencionadas anteriormente como las opciones óptimas para los estudios iniciales de morfología espermática en murciélagos.

The study of sperm morphology involves the use of various staining techniques that allow visualization of different structures of the spermatozoon and their variabili-ty. Each technique varies depending on the dyes used and the necessary steps for execution. The aim of this work was to evaluate different staining techniques for sperm morphology and morphometry analysis in bats. Samples were collected from the epididymis of 57 adult specimens, which were macerated in Farmer’s solution and used to prepare smears. The smears were stained with Toluidine Blue, Giem-sa, May Grünwald-Giemsa, Gram stain, Hematoxylin-Eosin, DAPI (4’,6-diamid-ino-2-phenylindole), Basic Fuchsin, and Janus Green. Criteria for comparing the techniques were complexity, time required, and associated costs., Microphotographs were taken using light and epifluorescence microscopy for morphometric analysis, and 50 spermatozoa were measured per individual. Spermatozoa were obtained from 16 specimens: Artibeus planirostris (n=5), Sturnira erythromos (n=3), Molossus molossus (n=4), Molossops temminckii (n=2), Histiotus laephotis (n=1), and Myotis albescens(n=1). Among the evaluated techniques, Toluidine Blue proved to be a quick, simple, and cost-effective method in order to determine the presence of spermatozoa and describe their general morphology. Dicromatic stains like Hematoxylin-Eosin and May Grünwald-Giemsa were more efficient in differentiating the nucleus and acro-some, although they were also more complex and costly to perform. In conclusion, we recommend the use of the aforementioned three techniques as optimal choices for initial studies of sperm morphology in bats.