Clonación y sobreexpresión de las prohibitinas 1 y 2 de Trypanosoma cruzi

Abstract

Las prohibitinas (PHB) 1 y 2 son proteínas conservadas, pertenecientes a la superfamilia SPFH (Stomatins, Prohibitins, Flotillins, HflK/C), con un dominio común PHB. En eucariotas superiores ésta familia está involucrada en eventos como: la proliferación celular, envejecimiento, apoptosis y el mantenimiento de la integridad mitocondrial. La familia de las prohibitinas, también puede actuar como chaperonas mitocondriales o jugar un papel en la biogénesis mitocondrial. Dentro del grupo de los tripanosomátidos, se comprobó su presencia en diferentes especies de Leishmania y en Trypanosoma brucei. En Leishmania donovani, se determinó que las prohibitinas juegan un papel importante en la interacción húesped-parásito, favoreciendo la infección del mismo. En cambio, en Trypanosoma brucei, se las encontró en las mitocondrias formando un complejo de proteínas, que participaría en el correcto plegamiento de las enzimas de la cadena respiratoria, actuando como chaperona / holdasa. Hasta el momento no hay estudios realizados en Trypanosoma cruzi. La comparación de las secuencias aminoacídicas de estas proteínas con la de eucariotas superiores, revelan un nivel de identidad entre 53 y 39% para la PHB1; y entre el 50 y el 34% para la PHB2. En los tripanosomátidos, estas proteínas se encuentran más conservadas, compartiendo valores de identidad hasta el 93%, sugiriendo un papel importante. Partiendo de extractos de proteínas totales de epimastigotas y amastigotas/tripomastigotas sanguíneos, a través de un Western blot se comprobó la presencia de las proteínas de estudio en estos estadios. Además, se realizó un rastreo de la presencia de los genes PHB1 y PHB2 por PCR en 7 cepas diferentes de T. cruzi, pertenecientes a distintos DTUs. Solo en la cepa CL-Brener estos genes se encuentran asignados a cromosomas, la primera se encuentra en el cromosoma 25 y la segunda en el cromosoma 38. En el presente trabajo, también se describe la clonación de expresión de los genes de estudio, partiendo de cDNA de epimastigotes de la cepa PAN4 (DTU I) en el vector pTREX-TAPtag-GW, la transfección y sobreexpresión de los mismos en las cepas DM28 (DTU I) y CL Brener (DTU VI).