Caracterización de aislados de Nothopassalora personata agente causal de la viruela tardía del maní

Abstract

El cultivo de maní (Arachis hypogaea L.) es afectado por dos enfermedades foliares importantes, la viruela temprana (Cercospora arachidicola) y la viruela tardía (Nothopassalora personata Syn. Cercosporidium personatum). En Argentina la viruela tardía, por su distribución y presencia en todos los ciclos agrícolas de las últimas décadas, es la enfermedad foliar con mayor potencial de daño para el cultivo. Actualmente la herramienta de control más eficiente es el uso de fungicidas, principalmente sitios específicos, que, por su uso sistemático, conlleva a un alto riesgo de desarrollar resistencia en las poblaciOnes del patógeno. Entre las características de N. personata se incluyen una baja capacidad de producir conidios en condiciones in vitro y un lento crecimiento micelial en medios de laboratorio estándar, lo que limita los estudios de etiología y epidemiología, así como una mejor comprensión de su biología (Monguillot et al., 2023). Dado el número limitado de estudios y la importancia de este patógeno en el cultivo de maní, el objetivo de este estudio fue caracterizar morfológica y molecularmente aislamientos de N. personata obtenidos de distintas áreas de producción de Córdoba, Argentina, y evaluar su patogenicidad.Materiales y Métodos Aislamiento: N. personata fue aislado de hojas sintomáticas colectadas en la campaña 2019-20 de seis loteslocalizados en Rio Cuarto, Las Perdices, General Deheza, Vicuña Mackenna, Pampayasta Sur y General Cabrera, mediante el método de aislamiento directo. Previo al aislamiento las hojas fueron desinfectadas y mantenidas en cámara húmeda por 72 h. Tejido estromático junto a conidióforos y conidios fueron transferidos a placas de Petri conteniendo agar agua (AA) con el objetivo de obtener conidios individuales que posteriormente fueron transferidos a placas con medio POA (extracto de hoja de maní+ avena + agar) + D (Dextrosa). Las placas fueron incubadas por diez días a 24 ºC con 12 h-fotoperiodo. Los cultivos puros obtenidos fueron preservados por el método Castellani.Caracterización morfológica: las colonias fueron estudiadas en medio de cultivo Spezieller Nährstof-farmer agar(SNA), luego de un período de incubación de 20 días a 24 °C en condiciones de luz/oscuridad de 12/12 h. La caracterización de los conidios se llevó a cabo en medio de cultivo POA y en planta, midiendo largo y ancho utilizando el software ImageJ.Caracterización molecular: El ADN genómico se extrajo a partir de micelio obtenido en medio líquido (papa dextrosa + extracto de hojas (30 g/L), en agitación continua (130 rpm, 24 °C con un fotoperíodo de 12 h) usando el protocolo de Doyle y Doyle (1987) con modificaciones (Conforto et al., 2019). Para la identificación molecular, se realizó la amplificación por la técnica de PCR y posterior secuenciación de los genes LSU, ITS, RPB2 (Videiraet al., 2017). Las secuencias consenso de cada aislado se compararon con la secuencia de la especie tipo de N. personata. El análisis filogenético se realizó mediante inferencia Bayesiana.Crecimiento micelial: fue evaluada en cuatro medios de cultivo: POA, papa dextrosa agar (PDA), extracto de hoja de maní agar (PLA) y extracto de grano de maní agar (PGA). El ensayo se realizó con seis aislados, y con cuatro repeticiones por aislado. Un disco de micelio de 3 mm de diámetro obtenido del margen de las colonias, en activo crecimiento en medio PDA fue transferido a las placas conteniendo los diferentes medios de cultivo. Las placas de Petri se incubaron a 24 °C en 12/12 h luz/oscuridad durante tres semanas. El diámetro de las colonias fue medido en dos direcciones perpendiculares, utilizando un calibre digital. Los datos fueron comparados utilizando ANOVA y las comparaciones de medias se realizaron utilizando Statistix 9.0.Pruebas de patogenicidad: el inóculo de cada uno de los aislados se cultivó individualmente en Erlenmeyers conteniendo 25 ml de medio de cultivo líquido PD + extracto de hojas, partiendo de un disco de micelio (3 mm).La incubación se realizó en un agitador orbital a 130 rpm, 24 °C con un fotoperíodo de 12 h. Después de diez días de incubación, el micelio fue macerado y posteriormente sembrado en placas de Petri conteniendo medioAA. Las placas se incubaron a 24 °C con un fotoperíodo de 12 h. Diez días después, 10 ml de agua destilada estéril + Tween 20% (0,01%) se agregó a cada placa y se retiraron los conidios utilizando una espátula Drigalsky. La suspensión de conidios se recolectó en un tubo eppendorf y la concentración se ajustó a 1 × 104 conidios porml. Las hojas de maní (cv. Granoleico) previa desinfección, se colocaron en placas de Petri y las condiciones de humedad se mantuvieron colocando en el extremo de cada pecíolo un algodón humedecido con 5 ml de agua destilada estéril. Las hojas fueron inoculadas con una gota de 10 µl de la suspensión de conidios. Las placas dePetri se colocaron en una cámara de incubación a 24 °C con un fotoperiodo de 12 h. Las pruebas se realizaron con tres repeticiones por aislado y el experimento fue repetido dos veces.ResultadosSe caracterizaronseis aislados, uno por cada localidad. Los aislados presentaron crecimiento lento (0,45 mm/día), con colonias inicialmente de color blanco, compactas, de borde irregular, con micelio aéreo compuesto de hifas septadas, color pardo-oliváceo. Conidióforos tabicados agregados, surgiendo del tejido estromático, de color marrón pálido a marrón, rectos a curvos o geniculados-sinuosos (en planta e in vitro). Los conidios son solitarios, septados, rectos o ligeramente curvos, de color marrón pálido a marrón, con las siguientes dimensiones: en planta: (22,7) 34,4 (50,4) x (6,4) 7,9 (9) μm, y 1 a 6 septos, in vitro: (28) 44,9 (58,9) x (5,1) 7 (8,4) μm, de 3 a 5 septos.A partir del análisis Bayesiano de inferencia filogenética los seis aislados se agruparon en un clado fuertemente soportado con la especie tipo de N. personata (PP:1.0). De la comparación entre los cuatro medios de cultivo después 21 días, se observó el mayor crecimiento en medio PGA(12,89 mm), seguido de PDA (12,02 mm), PLA (11,88 mm) y POA (10,3 mm). Si bien, no existieron diferencias significativas (LSD p < 0,05) entre los medios PGA y PDA, PGA si difirió significativamente de los medios PLA y POA.En la prueba de patogenicidad, todos los foliolos presentaron síntomas típicos de la viruela del maní. En la superficie adaxial, en el punto de inoculación, los síntomas comenzaron como pequeñas manchas circulares oscuras, en algunos casos se pudo observar la presencia de un halo clorótico. No se observaron síntomas en el control negativo. El patógeno fue re-aislado de las hojas inoculadas, para cumplir con los postulados de Koch.ConclusionesEste es el primer estudio que se realiza en Argentina focalizado en aspectos morfológicos moleculares y de patogenicidad de N. personata agente causal de la viruela tardía del maní.La información generada en este trabajo contribuye a futuros estudios epidemiológicos y de manejo de esta enfermedad.