Cuantificación de actividad feruloil esterasa bacteriana mediante espectrofotometría: puesta a punto y caracterización enzimática en cepas de lactobacilos

Abstract

Las feruloil esterasas (FE) son enzimas de creciente interés biotecnológico dada sus variadas aplicaciones. Las técnicas para el estudio de las FE de bacterias lácticas (BL), de especial relevancia en el desarrollo de probióticos e inoculantes para ensilajes, abarcan la espectrofotometría de nitrofenil derivados, la cual requiere que dichas enzimas se encuentren purificadas [Fritsch y col, 2017], y la cromatografía líquida de alta precisión [Abeijón y col, 2011]; estas metodologías son laboriosas y relativamente costosas. Por tanto, el objetivo de este trabajo es describir un protocolo novedoso de cuantificación de Actividad FE (AFE) aplicable para suspensiones celulares de BL; seguidamente, evaluar la fiabilidad de dicho método para caracterizar la AFE en diferentes condiciones de temperatura y pH. Materiales y métodos: Suspensiones de células bacterianas en buffer MOPS 100 mM pH 7 fueron incubadas a 37°C en proporción 1:2 con una solución de metil ferulato 100 μM en dicho buffer. Tras 15 min, la mezcla de reacción fue sometida a centrifugación y la absorbancia de la fracción superior del sobrenadante se midió a 340 nm. Para la cuantificación se empleó una curva de calibración del sustrato (0-83 μM) expresando los resultados en Unidades (U) de Actividad Enzimática Específica, equivalentes a nm de metil ferulato consumidos/min/g de células. Además, se evaluó la técnica a 18°C, así como a pH 4 y 5 (37°C, acidificación con ácido láctico). Los valores obtenidos se compararon con la cuantificación de metil ferulato mediante HPLC y con la estimación por diámetro del halo de hidrólisis en medio MRS agar con la adición de etil ferulato (1 g/L). Los estudios estadísticos se realizaron mediante ANOVA y las medias fueron comparadas mediante el Test de Tukey. Resultados: El sustrato fue estable en todas las condiciones estudiadas y los valores obtenidos son consistentes (Factor cepa=p<0,0001), variando de 35 U ({L. spp} aislada de silos de maíz) a 698 U ({L. johnsonii} CRL1231 a pH 7 y 37°C). Los resultados son coincidentes con los obtenidos por los otros métodos de cuantificación mencionados. Las BL de origen animal y humano estudiadas poseen una AFE de 1,5 a 20 veces mayor a la detectada en las cepas de origen vegetal. En la mayoría de los casos, las mayores U se encontraron a pH 7 y 37°C; sólo 4 cepas, aisladas de fuentes vegetales, presentaron una mayor AFE a pH 4 y 5, o a 18°C. Conclusiones: Se presenta un método consistente, rápido y de bajo costo para la cuantificación de la AFE, basado en la metodología publicada por Yue y col. (2009) para enzimas purificadas, y que asimismo permite la caracterización de las condiciones óptimas en cada caso. Los resultados sustentan la potencial aplicación de BL de origen intestinal caprino como inoculantes fibrolíticos para ensilajes; se destacan especialmente las especies {L. johnsonii}, {L. taiwanensis} y {L. fermentum} por su gran capacidad hidrolítica, la cual se mantiene a temperatura y pH bajos.