Estudios proteómicos dependientes de gel en levaduras resistentes a Cr(VI)

Abstract

{Wicherhamomyces anomalus} y {Candida glabrata}, aisladas a partir de sedimentos de Río San Luis, Argentina, mostraron capacidad de remover concentraciones entre 25 y 100 mg L^-1 de Cr(VI) en medio líquido. El objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto de Cr(VI) en la expresión de proteínas celulares de ambas cepas, mediante técnicas proteómicas dependientes de gel.{W. anomalus} y {C. glabrata} se cultivaron en medio EG (g L^-1: glucosa 10; extracto de levadura 1; K_2HPO_4 y KH_2PO_4 0,125; MgSO_4 0,1), con y sin la adición de 50 mg L^-1 de Cr(VI), durante 72 h y 200 rpm. La biomasa se obtuvo por centrifugación de 50 mL de cultivo a 4000 {xg} durante 20min a 4°C. Las biomasas se lavaron dos veces con PBS (mM: NaCl 124; NaH_2PO_4 10; KH_2PO_4 3) y se conservaron a -20°C. La ruptura mecánica de las células se realizó en mortero, con N_2 líquido. El polvo obtenido se recuperó con 5mL de Buffer Tris-Sacarosa y se centrifugó a 8.500 {xg} durante 20min a 4°C para eliminar los restos celulares. La concentración de proteínas se determinó con el método de Bradford, se liofilizaron y luego se reconstituyeron en 1 mL de Tritón X100 0,05% en PBS, 1 h a 4°C sin agitación. Las proteínas se resolvieron por SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 15%, a 80V durante 20 min y 120V por 2 h. El gel obtenido se tiñó con Coomassie R-250. Para la identificación de las proteínas, los carriles de cada una de las muestras fueron cortados en 7 segmentos y digeridos con Tripsina (Promega). Los péptidos resultantes se analizaron a través de nanoLC-ESI-MS/MS y para la identificación se utilizaron bases de datos de NCBInr y Bioinformatics Solutions Inc. (ON, Canadá).En presencia de Cr(VI) se identificaron 54 proteínas sobre-expresadas en {C. glabrata} y 179 en {W. anomalus}. Ambas cepas sobre-expresaron proteínas asociadas a: la síntesis de biomoléculas, metabolismo glicolítico, quinasas/fosfatasas que podrían ser claves en la activación o desactivación de vías de señalización intracelulares y proteínas involucradas en procesos de óxido-reducción. Por otro lado, en {W. anomalus} se identificaron además proteínas involucradas en la respuesta al estrés oxidativo, metabolismo de ácidos nucleicos y proteínas de degradación que no se encontraron expresadas en {C. glabrata}. En ambas cepas, la presencia de Cr(VI) afectó la expresión de proteínas celulares pero de manera diferente, lo que podría corresponderse con diferencias en los mecanismos implicados en la respuesta frente a la presencia de este toxico. Estos resultados indican que {W. anomalus} expresa un mayor número de proteínas en presencia de Cr(VI), especialmente aquellas que les permite afrontar una situación de estrés, esto condice con la capacidad de reducción del metal. En trabajos previos se mostró que en presencia de 50 mg L^-1 de Cr(VI) {W. anomalus} removió un 80% del metal mientras que {C. glabrata} solo removió un 50% del mismo.