La expresión heteróloga de las isoformas Dot1a y Dot1b de Trypanosoma cruzi rescata el fenotipo salvaje en levaduras mutantes condicionales

Abstract

Trypanosoma cruzi posee un ciclo de vida complejo, alternando entre un insecto vector y un mamífero hospedador. Durante esa alternancia sufre cambios que requieren de una regulación génica precisa. Si bien en T. cruzi la principal regulación de la expresión génica es post transcripcional, la transcripción puede modularse por modificaciones post traduccionales de histonas que alteran la cromatina y afectan la compactación del ADN. T. cruzi cuenta con dos isoformas de las proteínas metiltransferasas Dot1 que metilan la lisina 76 de la histona H3. Mediante estudios previos de cepas doble y simple knockout para dichos genes, se describió que TcDot1a, es responsable de mono y di metilar, y TcDot1b, principalmente de tri metilar. Sin embargo, sus respectivas actividades enzimáticas aún no fueron evaluadas de manera independiente.Para comprender mejor la capacidad de cada una de llevar a cabo la actividad metiltransferasa, se transformó la cepa mutante de S. cerevisiae, dot1Δ, con las proteínas TcDot1a y TcDot1b, por separado, clonadas en el plásmido pRS416. Ambas fueron etiquetadas con hemaglutinina (HA) posibilitando la confirmación de su expresión mediante Western blot. La cepa dot1Δ es resistente al golpe de calor. Con el fin de evidenciar si la incorporación de cada proteína de T. cruzi puede rescatar dicho fenotipo, se expusieron las levaduras transformadas a un heat shock seguido de una incubación a 30° por 48 horas. Pudimos observar que la incorporación de ambas proteínas, de manera independiente, rescatan el fenotipo observado en la dot1Δ; otorgándole sensibilidad al golpe térmico. Como control se utilizó la cepa BY4741 wild type. Con los resultados obtenidos podemos concluir que ambas proteínas tendrían capacidad metiltransferasa independientemente de la presencia de la otra isoforma. Para poder corroborar el patrón de metilación mediado por cada una, complementaremos este estudio analizando los niveles de metilación de H3K76 con anticuerpos específicos.