Determinación por microscopía raman de las modificaciones bioquímicas y estructurales en el citoplasma de ovocitos bovinos durante la maduración in vitro

Abstract

En los últimos años, las técnicas aplicadas en la producción in vitro de embriones bovinos han cobrado gran importancia, no obstante, la calidad de los embriones obtenidos por estas metodologías dista de ser similar a los desarrollados in vivo. Se demostró que la calidad de los ovocitos es un factor determinante en la eficiencia de este proceso, por lo tanto, la capacidad de identificar ovocitos madurados in vitro competentes para la fecundación podría contribuir a un aumento en las tasas de producción de embriones. Durante la maduración, el ovocito sufre cambios bioquímicos y morfológicos, a nivel nuclear y citoplasmático, separados temporal y espacialmente, pero sincronizados entre sí. El primero, consiste en la segregación cromosómica durante la reanudación de la primera división meiótica, mientras que el segundo involucra el aumento y la reorganización de diferentes orgánulos como así también la acumulación de ARNm, proteínas y lípidos. El objetivo de este trabajo fue estudiar, mediante microscopía Raman, las modificaciones bioquímicas del citoplasma en los ovocitos bovinos a lo largo del proceso de maduración in vitro. Se estudiaron los ovocitos inmaduros (INM) y otros que permanecieron en las condiciones de maduración in vitro durante 6, 18 y 22 horas (MIV-6H, MIV-18H y MIV-22H). Para un análisis más preciso de los cambios en el citoplasma a lo largo de este proceso, se eliminó la zona pelúcida (ZP) de todos los ovocitos mediante tratamiento enzimático. Posteriormente los ovocitos sin ZP fueron fijados en formaldehído al 4% en PBS, lavados y conservados en PBS/ BSA a 4 °C. Los espectros Raman se adquirieron utilizando un microscopio confocal acoplado a un espectrómetro Raman, con un objetivo de 20X, en 5 diferentes puntos del citoplasma de cada ovocito. Con el fin de poder realizar la comparación espectral, se obtuvo un espectro representativo de cada grupo, mediante la suma de los espectros de cada ovocito. Los espectros del grupo MIV-6H mostraron que las intensidades de las bandas de azúcar disminuyeron, mientras que las intensidades de las señales lipídicas aumentaron considerablemente, con respecto al espectro de ovocitos INM. Ello se debería a la utilización de glúcidos como fuente de energía al inicio de la maduración y a un aumento de la cantidad de gotitas lipídicas, cuyo componente principal son los triglicéridos. Los espectros MIV-18H no mostraron diferencias espectrales con respecto al contenido de lípidos y proteínas en comparación con el grupo MIV-6H. Sin embargo, se observó que las intensidades de las bandas características de proteínas aparecieron aumentadas en los espectros MIV-22H con respecto a los otros 3 grupos. La intensidad de la señal que corresponde a los triglicéridos (1732 cm-1) disminuyó en comparación al grupo MIV-18H, lo que indica que los triglicéridos fueron utilizados como fuente de energía en las últimas horas de la maduración. Estos resultados muestran que la espectroscopía Raman puede ser utilizada como una poderosa herramienta analítica para analizar la calidad de los ovocitos bovinos madurados in vitro.