Inactivación de bacteriofagos mediante UV para la posterior evaluación de enzimas fágicas

Abstract

La apremiante necesidad de desarrollar estrategias de control de bacterias alternativas al uso deantimicrobianos ha dado relevancia al empleo de bacteriófagos y enzimas fágicas. Para evidenciar lapresencia de estas enzimas y otros componentes antibacterianos útiles para biocontrol, se requierenestrategias que permitan una evaluación de la actividad antibacteriana independiente de lareplicación fágica. Se sabe que la luz ultravioleta (UV) daña los ácidos nucleicos impidiendo lareplicación del ADN y la transcripción del ARN, lo que finalmente causa la inactivación de losmicroorganismos y, aunque otros componentes pueden resultar dañados, también puedenmantenerse actividades enzimáticas. En base a esto, el tratamiento con luz UV permitiría inferir lapresencia de componentes con acción antimicrobiana. Nos propusimos como objetivo evaluar lascondiciones necesarias para lograr la inactivación de bacteriófagos, aislados por nuestro grupo detrabajo, que presentan actividad lítica contra Escherichia coli productor de toxina Shiga. Dado que laluz UV tiene limitada capacidad de penetrar en un líquido, colocamos 500 μl de la suspensión delfago L7.3 (stock de alto título fágico, ~1x10 10 UFP/ml) de manera que forme una capa muy delgadasobre las placas de Petri de vidrio utilizadas. Realizamos un primer ensayo en el que evaluamos 3tratamientos con luz UV de una longitud de 254 nm a 10 cm de distancia (T1: 5? de exposición sinagitación; T2: 20? de exposición sin agitación; T3: 1?40? de exposición realizando 2 agitacionesintermedias de forma manual) así como un control sin tratar (stock fágico colocado en placa de Petrisin exponer a luz UV). Se realizó un ensayo en doble capa de agar y un spot test para cuantificar losfagos que conservaron su infectividad, colocando diferentes diluciones de los fagos tratados y delcontrol, empleando la cepa E. coli DH5α como hospedadora. Posteriormente, se realizó un nuevoensayo con mayor tiempo de exposición a luz UV ( (5´ 20 ") y agitaciones manuales cada 20? (T4). Seobservaron disminuciones de ufp de ~2 log por efecto del tratamiento T1, 1 log por T2 y ≥ 9 log porT3 y T4. En estos 2 últimos tratamientos, se observó efecto lítico sin presencia de placas de lisis conlas menores diluciones de la suspensión tratada, en el ensayo de spot test. Este estudio permitióidentificar tratamientos con luz UV eficaces para inactivar este fago y continuar detectando actividadlítica. Dadas las características de la luz UV, se destaca la importancia de la agitación durante eltratamiento.