Estudio de proteínas involucradas en la biogénesis de la citocromo C oxidasa y su papel en el metabolismo energético, el desarrollo vegetal y la respuesta a estrés

Abstract

En los organismos eucariotas, las mitocondrias son las organelas encargadas detransformar el poder reductor generado por los distintos procesos metabólicos celularesen ATP. Este proceso es llevado a cabo en la membrana interna mitocondrial mediantela cadena de transporte de electrones. La misma está compuesta por 4 complejosmultiproteicos que transportan los electrones desde los cofactores reducidos hacia eloxígeno, translocando protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembranadurante este proceso. Finalmente, este gradiente electroquímico es utilizado por elcomplejo V para la síntesis de ATP. La estructura de todos estos complejos ha sidoextensamente estudiada en levaduras y en mamíferos. Gracias a esto se conoce que elensamblado de los mismos es un proceso sumamente coordinado, que requiere de lacorrecta expresión del genoma nuclear y el mitocondrial para la producción de lasdistintas subunidades. Sumado a esto, es necesario que las proteínas de codificaciónnuclear sean correctamente importadas y ensambladas en la mitocondria. Además, lamayoría de estos complejos posee grupos prostéticos, los que suman un nivel extra decomplejidad, dado que requieren de proteínas que se encarguen de su síntesis einserción. Finalmente, las plantas, por ser organismos sésiles, poseen vías de ingreso deelectrones extras así como también una oxidasa alternativa, las cuales no acoplan sufuncionamiento a la translocación de protones. El complejo IV o Citocromo c Oxidasa,(COX), es la enzima terminal de la cadena de transporte de electrones. Este complejoestá compuesto por 3 subunidades de codificación mitocondrial (COX1, COX2 yCOX3) y 7-10 subunidades de codificación nuclear. COX cuenta con 2 centros de cobrey 2 grupos hemo a. Se conoce, por estudios en levaduras, que para el ensamblado deCOX son necesarias numerosas proteínas que participan en la inserción de lassubunidades y en la síntesis e inserción de los cofactores. Búsquedas bioinformáticas enArabidopsis thaliana han identificado supuestas proteínas homólogas a factores deensamblado de COX, entre ellas OXA1, COX10, COX11, SURF1, COX15, COX17,COX19, COX23 y SCO1. COX10, COX15 y SURF1 participarían en la formación einserción del grupo hemo a. COX17, COX19 y COX23 participarían en el transporte decobre hacia SCO1 y COX11. Estas últimas serían las encargadas de la inserción yformación de los centros de cobre en COX.13En la presente tesis, nos propusimos estudiar la función de la proteínainvolucrada en la biosíntesis del grupo hemo a AtCOX10, así como profundizar en elentendimiento del rol biológico que tienen las proteínas de tipo Sco, HCC1 y HCC2, enArabidopsis.En levaduras, Cox10p es una farnesil transferasa que cataliza la conversión delhemo b en hemo o. Es el factor limitante en la biosíntesis del hemo a y es esencial parala inserción de éste en COX. En este trabajo, se caracterizó AtCOX10, la probablehomóloga de Arabidopsis. AtCOX10 se localizó en la mitocondria y fue capaz derestaurar el crecimiento de la mutante nula de levaduras Δcox10 en fuentes de carbonono fermentables, sugiriendo su participación en la síntesis del hemo o. No se pudieronobtener plantas mutantes con inserción de ADN-T en ambos alelos de AtCOX10. Lasplantas heterocigotas mostraron semillas con embriones arrestados en estadios dedesarrollo tempranos, los que carecieron de actividad COX. Estas plantas tambiénexhibieron menores niveles de actividad COX y de respiración sensible a cianuro, perolos niveles de respiración total fueron normales a expensas de un incremento en larespiración alternativa. AtCOX10 parece estar implicada en el inicio y la progresión dela senescencia, ya que las mutantes heterocigotas mostraron una disminución más rápidadel contenido de clorofila y del rendimiento de los fotosistemas en comparación con lasplantas salvajes. Esto se observó durante la senescencia natural y la inducida poroscuridad. Sumado a esto, la complementación de las mutantes por la expresión delADNc de AtCOX10 bajo el control de su propio promotor permitió obtener plantas coninserciones de ADN-T en ambos alelos de AtCOX10. Las plantas complementadasmostraron características fenotípicas comparables con las de plantas salvajes. Estosresultados resaltan la relevancia de la síntesis del hemo o en plantas y sugieren que esteproceso es un factor limitante que influencia los niveles de actividad COX, larespiración mitocondrial y la senescencia.HCC1 en una homóloga de plantas de las proteínas Sco, las que estáninvolucradas en el tráfico e inserción de cobre en COX. Otra proteína similar, HCC2,está presente solamente en plantas y no tiene el dominio de unión a cobre. A pesar deello, HCC2 presenta un elevado grado de identidad y se conserva en todas las plantascon flores. Para estudiar el rol de HCC1 y HCC2, analizamos el perfil de transcripciónglobal de plantas mutantes en HCC2 (hcc2) y plantas que expresan un ARN antisentido14de HCC1 (As-HCC1). Un número significativo de genes presentó perfilestranscripcionales opuestos en las líneas analizadas. Las plantas hcc2 mostraron nivelesaumentados de transcriptos de respuesta a estrés, mientras que se observó unadisminución de éstos en plantas As-HCC1. Sumado a esto, se observó una correlaciónentre los genes inducidos en las mutantes hcc2 y los asociados con la regulación porespecies reactivas de oxígeno (ROS). En cambio, las plantas As-HCC1 presentaron unaregulación opuesta de estos genes. En concordancia con esto, las plantas hcc2 fueronmás tolerantes al estrés por NaCl mientras que las As-HCC1 fueron más sensibles.Además, al medir respiración durante el estrés, se observó que las plantas AS-HCC1presentaban una caída más temprana de la respiración dependiente de COX, con unconcomitante aumento de la respiración alternativa, mientras que las plantas hcc2mostraron una caída menor que las plantas salvajes. Esto indica que existe unacorrelación entre la respiración por la vía COX y la tolerancia al estrés. Por otro lado, enplantas hcc2 los genes de respuesta a estrés mostraron una inducción más temprana y/omayor luego de un tratamiento breve con NaCl. En cambio, en las plantas As-HCC1 larespuesta se vio inhibida. Ensayos de complementación bimolecular de la fluorescencia(BiFC) indicaron que ambas proteínas HCC son capaces de interaccionar in vivo. Losresultados sugieren que las proteínas Sco de plantas tendrían roles opuestos en lamodulación de la respuesta a estrés. Dado que HCC2 no posee los residuosinvolucrados en la unión a cobre, postulamos que podría actuar modulando la actividadde HCC1 a través de interacciones proteína-proteína.