Estudio de la inhibición de los canales de calcio presinápticos tipo CaV2 por la actividad constitutiva del receptor de ghrelina (GHSR) y su impacto sobre la actividad sináptica en neuronas hipocampales

Abstract

Los canales de calcio operados por voltaje tipo CaV2 presinápticos acoplan la despolarización de membrana al influjo de calcio, desencadenando la liberación de vesículas sinápticas que contienen neurotransmisores. Existen muchos mecanismos fisiológicos que controlan la actividad de los CaV2, siendo los receptores acoplados a proteína G (GPCR) uno de los más efectivos. Esta modulación ocurre mediante la alteración de la expresión, el tráfico o el funcionamiento de los CaV2 e impacta en la actividad neuronal. GHSR es un GPCR que posee una alta actividad constitutiva -independiente de la unión a ligando- la cual modula los CaV2 en un sistema de expresión heterólogo. A diferencia de la función fisiológica de su actividad evocada por ghrelina, el rol de su actividad constitutiva aún no se comprende completamente, debido a su naturaleza crónica y a la falta de agonistas inversos específicos. GHSR se encuentra ampliamente expresado en numerosos núcleos cerebrales con bajo acceso a la ghrelina plasmática como el hipocampo, donde se ha reportado que la aplicación de ghrelina exógena provoca distintos efectos, como la reorganización y el aumento de la densidad de espinas sinápticas, el incremento en la plasticidad a largo plazo y la neurogénesis. Así, en esta tesis postulamos que la modulación de los CaV2 por la actividad constitutiva de GHSR podría ser relevante en la neurotransmisión hipocampal. Nuestra estrategia experimental consistió en realizar registros de patch-clamp en configuración de célula entera en cultivos hipocampales primarios de embriones de 16-18 días de ratones C57BL6 salvajes y deficientes en GHSR, luego de manipular los niveles de expresión de GHSR mediante transducción lentiviral. Encontramos que la actividad constitutiva de GHSR reduce las corrientes nativas CaV2.1 y CaV2.2, siendo el CaV2.2 el subtipo más afectado. Luego, indagamos acerca del mecanismo por el que ocurre esta modulación mediante la coexpresión de versiones fluorescentes de los CaV2 y GHSR en un sistema de expresión heterólogo. Así, encontramos que la reducción de la corriente macroscópica conlleva una reducción de la densidad en membrana de CaV2.1 y CaV2.2, y además, demostramos que esta forma constitutiva de inhibición de los CaV por GHSR depende de la presencia de la subunidad auxiliar CaVβ. Este subconjunto de datos fue parte de dos trabajos publicados en colaboración con otros miembros de nuestro laboratorio. Al evaluar si la modulación de CaV2 por la actividad constitutiva de GHSR afecta la transmisión sináptica en el hipocampo, encontramos que ésta conduce a una disminución de la liberación del neurotransmisor inhibitorio GABA pero no de glutamato. Por otro lado, encontramos que GHSR no afecta la neurotransmisión inhibitoria o excitatoria independiente de los CaV ni la maquinaria de exocitosis de vesículas sinápticas. En base a nuestros resultados, postulamos que la selectividad del efecto de GHSR está vinculada con la mayor dependencia de la neurotransmisión GABAérgica del subtipo CaV2.2 respecto de CaV2.1. Esto es coincidente con varios estudios que reportan una mayor dependencia de la liberación de GABA con los CaV2.2, mientras que la neurotransmisión glutamatérgica depende en mayor medida de los CaV2.1. Para evaluar las consecuencias fisiológicas del efecto que observamos en neuronas en cultivo exploramos cómo afecta la actividad constitutiva de GHSR al circuito hipocampal intacto. El giro dentado es el punto de ingreso al circuito principal de la formación hipocampal, y funciona como un filtro fuertemente controlado mediante interneuronas locales. Observamos que la actividad constitutiva de GHSR reduce la transmisión GABAérgica local en el giro dentado en rebanadas horizontales de cerebro de ratón, mientas que no modifica la salida excitatoria del giro dentado a las neuronas piramidales de CA3. En resumen, en este trabajo de tesis doctoral estudiamos el efecto de la actividad constitutiva de GHSR sobre las corrientes CaV nativas y la transmisión sináptica en neuronas del hipocampo, un área con acceso restringido a ghrelina. El efecto de la actividad constitutiva de GHSR y su selectividad hacia la neurotransmisión GABAérgica dependiente de CaV2.2 podría tener importantes implicancias en los procesos fisiológicos que dependen del hipocampo como el aprendizaje y la memoria, en los cuales GABA ha ganado relevancia en los últimos años.

CaV2 channels couple membrane depolarization to calcium influx, triggering synaptic vesicle release containing neurotransmitters. There are many physiological mechanisms aimed at controlling CaV2 activity, GPCR activation being one of the most effective. This modulation is achieved by altering the expression, trafficking, or function of CaV channels affecting neuronal activity. GHSR is a GPCR that displays high constitutive activity -independent from its endogenous ligand, ghrelin- which has been described to regulate CaV2 in a heterologous system. Opposite to GHSR ghrelin-induced active mode, its constitutive active mode function is less understood due to its chronic nature and the scarcity of specific inverse agonists. GHSR is highly expressed in many brain nuclei with restricted access to plasma ghrelin, as the hippocampus, where exogenous ghrelin application results in reorganization and increase in the density of dendritic spines, augmentation of long term potentiation and neurogenesis. Hence, in this thesis we postulate that GHSR constitutive activity-mediated modulation of CaV2 could be relevant in the hippocampus. Our experimental strategy consisted in whole-cell patch-clamp recordings in hippocampal primary cultures from 16-18 days old C57BL6 wild type and GHSR deficient embryonic mice after manipulating GHSR expression with lentiviral transduction. We found that GHSR constitutive activity impairs CaV2.1 and CaV2.2 native calcium currents, being CaV2.2 the most affected subtype. Then, we explored the mechanism underlying this modulation using a heterologous expression system to coexpress fluorescent versions of each CaV2 and GHSR. We found that the reduction in the macroscopic current observed implies the reduction of CaV2.1 and CaV2.2 membrane density, and we also demonstrated that this constitutive form of GPCR inhibition of CaV depends on the presence of CaVβ subunit. This data subset was included in two peer-reviewed publications in collaboration with other lab members. When we evaluated if CaV2 modulation by GHSR constitutive activity could affect hippocampal CaV-dependent synaptic transmission, we found that the CaV2 basal impairment observed leads to a decrease in GABA but not glutamate release. We also found that GHSR does not affect CaV-independent synaptic neurotransmission nor the release machinery. We postulate that this selective effect is related to a higher CaV2.2 contribution over CaV2.1 to GABA release. This is in agreement with several studies that report a greater coupling of GABA release to CaV2.2, while glutamatergic neurotransmission depends to a greater extent on CaV2.1. To evaluate the physiological consequences of the effect we found in neurons in culture, we explored how GHSR constitutive activity affects the intact hippocampal circuit. The dentate gyrus is the entry point to the main circuit of the hippocampal formation, and it works as a filter strongly controlled by local interneurons. We observed that GHSR constitutive activity reduces local GABAergic transmission in horizontal mice brain slices, while it does not affect the glutamatergic output of the dentate gyrus towards CA3. In summary, in this thesis we aimed to study the effect of GHSR constitutive activity on hippocampal presynaptic CaV currents and synaptic transmission in neurons from the hippocampus, a brain area with restricted ghrelin access. The effect of GHSR constitutive activity and its selectivity towards GABAergic transmission relying on CaV2.2 could be of high relevance in hippocampaldependent physiological processes, in which GABA modulation has recently gained attention.