Localización precisa en el cromosoma 2 de QTL que controlan caracteres de fruto en tomate

Abstract

Cuatro QTL mayores se encuentran asociados a frutos alargados en el germoplasma del tomate cultivado (Solanum lycopersicum): ovate, sun, fs8.1 y fs2.1. El cultivar comercial Rio Grande de S. lycopersicum porta los alelos silvestres para los genes SUN y OVATE y el carácter índice de forma de fruto (fs I) es controlado en un 61,55% por los QTL fs2.1 y fs8.1 que presentan interacción epistática. El QTL fs2.1 (cromosoma 2) controla principalmente el extremo distal del fruto y otros caracteres de calidad como pH e índices L y ab de color. En base a estos antecedentes se plantea como hipótesis que la recombinación de marcadores moleculares en la base del cromosoma 2 permite estudiar la segregación mendeliana de caracteres de forma y calidad de fruto para localizar en forma más precisa a los QTL que los definen. El objetivo general de este trabajo es validar QTL que controlan caracteres de fruto en poblaciones segregantes avanzadas entre Rio Grande y LA1589. Además, localizar en forma precisa al QTL mayor fs2.1 asociado a frutos alargados en el cultivar Rio Grande e identificar el estadio de desarrollo del fruto en el que ejerce su efecto. Se plantean como objetivos específicos: 1) Evaluar a través de pruebas de progenie de padres recombinantes en la base del cromosoma 2 caracteres de morfología y calidad de fruto a fin de validar y localizar de forma precisa QTL de interés; 2) Evaluar en la descendencia de padres recombinantes el carácter fs I para minimizar la región que contiene a fs2.1; 3) Detectar el estadio de desarrollo del fruto en el que fs2.1 afecta la forma; 4) Proponer genes candidatos para fs2.1 haciendo uso de herramientas bioinformáticas. Como material vegetal se utilizaron familias derivadas por autofecundación de plantas recombinantes en la base del cromosoma 2 conteniendo a fs2.1. Estas plantas no segregaron para el QTL fs8.1 y derivan del cruzamiento entre Rio Grande (padre recurrente) y LA1589. Para llevar a cabo las pruebas de progenie, en cada familia generada se seleccionaron por marcadores moleculares plantas homocigotas para el alelo cultivado y otras homocigotas para el alelo silvestre en la región genómica segregante. Las plantas seleccionadas, incluyendo cinco plantas de Rio Grande y cinco de LA1589, se trasplantaron en invernadero a una distancia de 1 m entre hileras y 40 cm entre plantas. Para el objetivo específico 1 se realizó una prueba de progenie sobre la descendencia de 8 plantas recombinantes y se midieron 10 atributos morfológicos y 3 de calidad sobre un total de 1370 frutos. Se aplicó la prueba t de Student para comparar los valores medios de grupos homocigotas por familia para todas las variables. Solo dos familias presentaron diferencias significativas (p<0,05) entre grupos homocigotas para fs I indicando que el QTL que rige el carácter se encuentra en el segmento segregante compartido por ambas. De esta manera se logró acotar la región conteniendo a fs2.1 de 9,64 Mb a 4,48 Mb. No se pudo determinar la posición de los QTL para los demás caracteres analizados debido a que presentaron asociaciones erráticas a través de las diferentes familias. Sin embargo, mediante mapeo por intervalos simple se logró detectar QTL menores de morfología y calidad de fruto previamente detectados en una generación F3-BC1-S1 derivada del mismo cruzamiento interespecífico. Para el objetivo 2, en virtud de los resultados del objetivo 1, se midió únicamente el carácter fs I en un total de 94 plantas (546 frutos) producto de la descendencia de 9 plantas recombinantes en la base del cromosoma 2. Como resultado, dos familias presentaron diferencias significativas (p<0,05) entre grupos homocigotas para fs I acotando la región que contiene a fs2.1 de 4,48 Mb a 0,71 Mb. El objetivo específico 3 consistió en el análisis de frutos en desarrollo en los días 0, 3 y 5 después de antesis. Fue realizado durante dos ensayos evaluándose un total de 102 y 293 flores en los ensayos 1 y 2 respectivamente. Nuevamente se utilizó la descendencia de plantas recombinantes en la región estudio. Como resultado de la comparación entre genotipos homocigotas mediante la prueba t de Student se observaron diferencias en el índice de forma de fruto en desarrollo desde el día cero de antesis. Para el objetivo 4 se hizo uso de la herramienta BLAST de la página SOL Genomics Network y se obtuvieron los genes contenidos en el segmento de 0,71 Mb correspondiente a fs2.1. También se obtuvieron los transcriptomas de LA1589 y seis NIL de Rio Grande. Tres NIL presentan alelos cultivados en la región centromérica del cromosoma 8 y otras tres alelos de LA1589. Utilizando un algoritmo en R se realizó el análisis de expresión diferencial entre todos los genotipos haciendo uso del paquete DE-seq. Se lograron identificar 10 genes diferencialmente expresados en flores en antesis entre los genotipos Rio Grande y LA1589. En base a estos resultados, se concluye que QTL menores de morfología y calidad de fruto se localizan en la base del cromosoma 2 (segmento de 9,64 Mb). Además, se demostró que el QTL mayor fs2.1 ejerce su efecto sobre el carácter fs I desde antes de antesis y se localiza en un segmento de 0,71 Mb en la base del cromosoma 2 que contiene genes diferencialmente expresados.

The Rio Grande cultivar of Solanum lycopersicum carries the wild alleles at SUN and OVATE genes and the fruit shape index (fs I) is controlled in a 61.55% by fs8.1 and fs2.1 which have epistatic interaction. fs2.1 on chromosome 2 mainly controls the distal end of the fruit and other quality traits as pH and L and ab parameters of color. The goal of this work is to validate QTL controlling fruit traits using advanced segregating populations between Rio Grande and LA1589 of S. pimpinellifolium. Also, to fine map the QTL fs2.1 which is associated to elongated fruit in Rio Grande and to identified the development stage when it exerts its effect. The analyses were performed using families derived from selfed recombinant plants in the chromosome 2 region containing the fs2.1 QTL. These plants did not segregate for fs8.1 and derived from a cross between Rio Grande (recurrent parent) and LA1589. From progeny of each selected plant, homozygous plants for the cultivated and wild alleles were selected by molecular markers. Selected plants, five plants of Rio Grande and five of LA1589 were transplanted at greenhouse. Ten morphological and three quality traits were measured on green mature fruits. As a result, the region controlling fs I was narrowed down from 9.64 Mb to 0.71 Mb. Also, by simple interval mapping, it was possible to detect minor QTLs for morphology and quality traits previously detected in a F3-BC1-S1 generation derived from the same interspecific cross. When fruits of 0, 3 and 5 days after anthesis were analyzed in plants with and without fs2.1, differences since cero days were observed. Within the 0,71 Mb segment corresponding to fs2.1, 10 differentially expressed genes were identified in flowers at anthesis between LA158 and Rio Grande-like genotypes. This work demonstrates that minor QTL for morphology and quality fruit are located at the bottom of chromosome 2 (segment of 9.64 Mb). Besides, the major QTL fs2.1 exerts its effect on the fs I trait before anthesis fs2.1 is located in a 0.71 Mb segment at the base of chromosome 2 and contains differentially expressed genes considered as candidates.