Estudio de la respuesta inmune frente a infecciones genitales y su relación con la infertilidad: Contribución al diseño de estrategias inmunoprofilácticas contra Chlamydia trachomatis

Abstract

La infertilidad es un problema de salud pública que afecta a personas de todo el mundo. Una de las causas de infertilidad son las infecciones de transmisión sexual (ITS). La infección genital por Chlamydia trachomatis es la causa más común de ITS en todo el mundo y tiene un efecto significativo en la reproducción humana. Por otra parte, Mycoplasma hominis y Ureaplasma urealyticum son a menudo concomitantes con C. trachomatis y han sido descritos como microorganismos causantes de ITS que en diversas situaciones están estrechamente relacionados con trastornos de la salud reproductiva de mujeres y hombres. Teniendo en cuenta que la infertilidad relacionada con la presencia de infecciones genitales podría ser el resultado tanto de un efecto directo del agente infeccioso como de la respuesta inmune propia del individuo resulta importante investigar esa relación. Entre los factores inmunológicos involucrados en infertilidad, uno de los más estudiados es la presencia de anticuerpos antiespermáticos (ASA). Estos anticuerpos pueden encontrarse tanto en la mujer como en el hombre, y pueden afectar diferentes eventos del proceso de fecundación. Asimismo, las ITS producirían un cambio en las poblaciones leucocitarias presentes en el tejido junto con la producción de mediadores inflamatorios, como citoquinas y quimioquinas, entre otros, que podría alterar la fertilidad. Por otro lado, existe un gran interés en controlar las infecciones genitales. Particularmente, teniendo en cuenta el impacto mundial que produce la infección por C. trachomatis en la salud reproductiva de hombres y mujeres, existe un creciente interés en desarrollar una vacuna que pueda inducir una respuesta inmune protectiva sin generar patologías como alteraciones en la fertilidad. El objetivo general de la presente tesis fue investigar la relación entre la respuesta inmune asociada a infecciones genitales y la infertilidad, y contribuir al diseño de una estrategia de prevención de infección por C. trachomatis.En consecuencia, en primer lugar se analizó la prevalencia de infecciones genitales producidas por C. trachomatis, M. hominis y U. urealyticum en pacientes en consulta por infertilidad del hospital JB Iturraspe de la ciudad de Santa Fe. Luego se caracterizó el perfil de respuesta inmune en lavado vaginal y en semen de pacientes infértiles y fértiles, con y sin estas infecciones genitales. Particularmente, la expresión de citoquinas (IFN-γ, TNF-α; IL-17, IL-10, TGF-β, IL-6, IL-8), y factores de transcripción maestros de linfocitos T helper (LTh) (Th1: Tbet, Th2: GATA3, Treg: FOXp3 y Th17: RORγt) fue determinada por RT-qPCR. Por otro lado, mediante citometría de flujo se cuantificaron algunas citoquinas entre ellas IFN-γ, IL-10, IL-6, IL-17A. Con todos los resultados obtenidos se establecieron posibles relaciones entre el perfil de respuesta inmune hallado en los pacientes con y sin infecciones genitales y la infertilidad. En segundo lugar se diseñaron, optimizaron, desarrollaron y evaluaron diferentes formulaciones basadas en ADN plasmídico (ADNp) y proteína recombinante para inducir inmunidad hacia PmpD de C. trachomatis. Mediante un análisis in sílico se seleccionó un fragmento de PmpD denominado Fragmento 2 (F2), que contiene múltiples epitopes de linfocitos B (LB), conformacionales y lineales, y de linfocitos T (LT), con capacidad de unión a moléculas MHC II. La secuencia codificante del mismo fue insertada en un vector de expresión eucariota, precedida de un líder secretorio, para ser usado en la inmunización con ADNp. Asimismo, el fragmento se obtuvo por expresión recombinante en Escherichia coli. Se realizó un protocolo de inmunización prime-boost aplicando diversas vías de inoculación. Ratones hembra recibieron una dosis con ADNp desnudo administrado por vía intradérmica. Luego se administraron 2 refuerzos con F2 de la proteína polimórfica de membrana D (polymorphic membrane protein D: PmpD) recombinante por dos vías simultáneas: sistémica (subcutánea) y por vía de las mucosas (nasal), formulada con liposomas suplementados o no con un inmunoestimulante, Los inmunoestimulantes empleados fueron: oligodesoxinucleótidos (ODN) CpG y anfifilos Gemini (Gem). Para evaluar la respuesta inmune generada se determinaron los niveles de anticuerpos específicos IgG, IgG1 e IgG2a en suero e IgG e IgA en lavados vaginales. Por último, se evaluó la fertilidad in vivo de los animales inmunizados mediante el apareo con machos de fertilidad comprobada.Respecto al análisis de prevalencia, los resultados mostraron que el 29,9% de los 193 pacientes infértiles analizados presenta alguna de estas tres ITS, por lo tanto, las infecciones por C. trachomatis, M. hominis y U. urealyticum son potenciales causas de infertilidad. Particularmente, C. trachomatis y M. hominis son más prevalente en mujeres infértiles y U. urealyticum en hombres infértiles. Si bien la presencia de ASA se asoció a infecciones por C. trachomatis y U. urealyticum, los resultados obtenidos sugieren que los ASA no serían los principales factores que contribuyen a la infertilidad en los pacientes estudiados. Tanto los pacientes infértiles con ITS como sin ITS presentaron alteraciones en citoquinas y factores de transcripción maestros de LTh tanto en lavado vaginal como en plasma seminal. Las mujeres infértiles infectadas por C. trachomatis presentan una alteración en los factores inmunes, particularmente mediado por RORγt, IL-6 y correlaciones altamente significativas entre IL-10, INF-γ y IL-17A. Las pacientes infértiles infectadas con M. hominis presentan una alteración de la flora normal con vaginosis bacteriana y un desequilibrio inmunológico potencialmente mediado por IL-10, IL-8, IL-17A, IL-6, RORγt. Las pacientes infértiles infectadas con U. urealyticum presentaron una alteración de factores inmunes, mediada por IFN-γ, RORγt, GATA3, FOXp3. Respecto a los resultados obtenidos sobre parámetros espermáticos en pacientes masculinos, U. urealyticum no produciría efectos directos sobre los espermatozoides. Sin embargo, se observó un aumento de TNF-α e IL-10 en plasma seminal. En conjunto, estos resultados apoyan la hipótesis de que las ITS producen alteraciones en el ambiente inmunológico que podrían impactar negativamente en la fertilidad. Por otra parte, en ausencia de infección, las mujeres infértiles presentan claras alteraciones en los factores inmunológicos pero la mayoría presenta microbiota normal. Particularmente, la disminución de TGF-β, una citoquina clave para la reproducción, y el aumento de una de las principales citoquinas proinflamatorias INF-γ junto con el aumento de RORγt los cuales podrían ser factores que contribuyen a la infertilidad en mujeres infértiles sin infección. El fragmento de PmpD de C. trachomatis seleccionado sobre la base del análisis in silico fue insertado en un plásmido de expresión eucariota para inmunización génica. Asimismo, se logró expresar y purificar la proteína recombinante F2 de PmpD, que se empleó para la inmunización utilizando la estrategia de prime-boost. El diseño desarrollado tiene como objetivo inducir una respuesta tendiente a un perfil Th1 y anticuerpos específicos. La estrategia de prime-boost generó una robusta respuesta humoral, tanto sistémica como local (en mucosa vaginal) en un modelo murino, con todas las formulaciones evaluadas. Particularmente, la formulación que contenía la proteína acompañada de liposomas catiónicos y CpG generó altos niveles de anticuerpos IgG2a séricos específicos lo que sugiere que este inmunoestimulante dirige la respuesta hacia un perfil Th1, e IgG en mucosa vaginal. Por otro lado, la formulación con liposomas con inmunoestimulante Gem condujo a la producción de anticuerpos de isotipo IgA en vagina. Las formulaciones evaluadas mediante la estrategia de prime-boost no exhibieron alteraciones en los parámetros de fertilidad evaluados (potencial de fertilidad, tasa de pérdida pre- y pos- implantación). El presente trabajo de tesis permitió por un lado comprender los factores locales que regulan la inmunidad de las mucosas en pacientes infértiles con y sin infecciones genitales y por el otro diseñar, desarrollar y evaluar diversas formulaciones vacunales para lograr inmunidad contra C. tachomatis sin alterar la fertilidad.En conjunto, este trabajo brinda elementos para una mejor comprensión de los trastornos reproductivos y aporta posibles herramientas para la prevención de una ITS con gran impacto en la salud reproductiva y neonatal.

Infertility is a public health problem that affects people worldwide. Sexually Transmitted Infections (STI) are a common cause of human infertility. Genital infection with Chlamydia trachomatis is the most common cause of STI worldwide and has a significant effect on human reproduction. On the other hand, Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum are often concomitant with C. trachomatis and have been described as causative organisms of STI that in various situations are related to reproductive health disorders in women and men. Considering that infertility related to the presence of genital infections could be the result of both a direct effect of the infectious agent and the individual's immune response, it is important to investigate this relationship. Among the immunological factors involved in infertility, one of the most studied is antisperm antibodies (ASA). These ASA can be found in both women and men and can affect different events of the fertilization process. Moreover, STI would produce a change in leukocyte populations in the tissue with the production of inflammatory mediators, such as cytokines and chemokines, among others, which could alter fertility. There is a great interest in controlling genital infections. Particularly, taking into account the global impact of C. trachomatis infection on the reproductive health of men and women, there is a growing interest in developing a vaccine that can induce a protective immune response without generating pathologies such as alterations in fertility. The general objective of this thesis was to investigate the relationship between the immune response associated with genital infections and infertility, and to contribute to the design of a strategy to prevent C. trachomatis infection. First, the prevalence of genital infections caused by C. trachomatis, M. hominis and U. urealyticum in patients consulting for infertility at Iturraspe Hospital in Santa Fe, Argentina was analyzed. Then, the immune response profile in vaginal washing and in semen of infertile and fertile patients with and without these genital infections was characterized. Particularly, the expression of cytokines (IFN-γ, TNF-α, IL-17, IL-10, TGF-β, IL-6, IL-8), and master transcription factors of T helper cells (Th1: Tbet, Th2: GATA3, Treg: FOXp3 and Th17: RORγt) was determined by RT-qPCR. A principal component analysis, for reducing the dimensionality of such datasets, increasing interpretability but at the same time minimizing information loss was made. Moreover, a Spearman correlation between pairs of immune factors was made using InfoStat software. Some cytokines such as IFN-γ, IL-10, IL-6, IL-17A were quantified by flow cytometry. The relationship between the immune response profile found in patients with and without genital infections and infertility was analyzed. Second, different formulations based on plasmid DNA (pDNA) and recombinant protein were designed, developed and evaluated to induce immunity to C. trachomatis PmpD. In silico prediction of B-cell and T-cell epitopes within the amino acid sequence of PmpD was made. A fragment of PmpD named F2 was selected, which contains multiple conformational and linear B-cell, and T-cell epitopes capable of binding to MHC II molecules. The coding sequence of F2 was inserted into a eukaryotic expression vector, preceded by a secretory leader, to be used in pDNA immunization. Moreover, the fragment F2 was obtained by recombinant expression in Escherichia coli. A prime-boost immunization protocol was applied by different routes of inoculation. Female mice received intradermally a dose with naked pDNA. Then, two doses were administered with recombinant PmpD F2 by two simultaneous routes: systemic (subcutaneous) and mucosal (nasal), formulated with liposomes supplemented with or without an immunostimulant. The immunostimulants used were: CpG oligonucleotides and Gemini amphiphiles. To evaluate the generated immune response, the levels of specific IgG, IgG1 and IgG2a antibodies in serum and IgG and IgA antibodies in vaginal washings were determined. Finally, the in vivo fertility of the immunized animals was evaluated by mating with males of proven fertility. Regarding the prevalence analysis, the results showed that 29% of the 193 infertile patients analyzed have any of these three STI, therefore, infections by C. trachomatis, M. hominis and U. urealiticum are potential causes of infertility. Particularly, C. trachomatis and M. hominis are more prevalent in infertile women and U. urealyticum in infertile men. Although the presence of antisperm antibodies was associated with C. trachomatis and U. urealyticum infections, the results suggest that ASA would not be the main contributing factors to infertility in the patients studied. Infertile patients with and without STI presented alterations in cytokines and master transcription factors of T helper cells both in vaginal washing and in seminal plasma. Particularly, infertile women infected with C. trachomatis show alterations in the immune factors, particularly mediated by RORγt, IL-6 and highly significant correlations among IL-10, INF-γ and IL-17A. The infertile female patients infected with M. hominis present an alteration of the normal flora with bacterial vaginosis and an immune imbalance potentially mediated by IL-10, IL-8, IL-17A, IL-6, RORγt. Infertile women infected with U. urealyticum present alterations of immune factors, that are mediated by IFN-γ, RORγt, GATA3, FOXp3. Regarding the results obtained on sperm parameters in male patients, U. urealyticum would not have direct effects on the sperm. However, an increase in TNF-α and IL-10 in seminal plasma was observed. Taken together, these results support the hypothesis that STI produce alterations in the immune environment that could negatively impact fertility. On the other hand, in the absence of infection, infertile women show clear alterations in the immunological factors but most of them present normal microbiota. Particularly, the decrease of TGF-β, a key cytokine for reproduction, and the increase of one of the main proinflammatory cytokines, INF-γ, together with the increase of RORγt could be contributing factors to infertility in infertile women without infection. The F2 fragment from C. trachomatis PmpD, selected on the basis of in silico analysis was inserted into an eukaryotic expression plasmid for gene immunization. Likewise, it was possible to express and purify the recombinant protein F2 of PmpD, which was used for immunization using the prime-boost strategy. The developed design aims to induce a response tending to a Th1 profile and specific antibodies. The strategy of prime-boost generated a robust humoral response, both systemic and local (in vaginal mucosa) in a murine model, with all the formulations evaluated. Particularly, the formulation containing the protein accompanied by cationic liposomes and CpG generated high levels of specific serum IgG2a antibodies suggesting that this immunostimulant directs the response towards a Th1 profile, and IgG in vaginal mucosa. On the other hand, the formulation with liposomes with gemini immunostimulant led to the production of IgA isotype antibodies in the vagina. The formulations administered by the prime-boost strategy did not generate alterations in the evaluated fertility parameters (fertility potential, pre- and posimplantation loss rate). The present work of the thesis allowed on the one hand to understand the local factors that regulate the immunity of the mucosa in infertile patients with and without genital infections and on the other, to design, develop, and evaluate various vaccine formulations to achieve protective immunity against C. trachomatis without altering fertility. Taken together, this work provides elements for a better understanding of reproductive disorders and provides possible tools for the prevention of STI with a great impact on reproductive and neonatal health.