Participación de la Esfingosina Cinasa en la Diferenciación Celular y Organización Tisular

Abstract

La esfingosina cinasa (SphK) sintetiza esfingosina-1-fosfato (S1P), un esfingolípido bioactivo con importantes acciones biológicas. Los esfingolípidos son moléculas que no solo presentan una fun- cionalidad estructural, sino que, además, cada uno posee una actividad biológica característica, encontrándose acciones biológicas asociadas a un tipo molecular especifico. La S1P puede actuar intracelularmente o a través de alguno de los cinco receptores acoplados a proteína G, por lo que resulta un ligando con acciones autocrinas y paracrinas.La diferenciación celular de las células epiteliales renales es un proceso que involucra la transi- ción mesénquima-epitelio (MET). Durante la MET, células mesenquimales se tornan polarizadas, desarrollando un dominio apical y uno basolateral, al mismo tiempo que establecen sus uniones célula-célula y célula-matriz. Esta transición se desencadena por una intrincada señalización mo- lecular, en donde es necesaria una hipertonicidad extracelular, que además es requerida para el mantenimiento del estado diferenciado. En este sentido, la homeostasis celular depende de un correcto recambio celular que garantice la integridad del tejido, permitiendo la funcionalidad del mismo.El objetivo de la presente tesis consistió en estudiar la participación de la S1P en el proceso de MET de células epiteliales renales, así como también en mecanismos de homeostasis una vez que el estado diferenciado ya se ha establecido. Para ello, se utilizó la línea celular MDCK, derivada de células de túbulo colector renal, un modelo prototipo para estudiar polarización y diferenciación celular.Inicialmente, se abordó el estudio de la vía SphK1/S1P durante el desencadenamiento de la di- ferenciación celular. Los resultados mostraron que tanto la expresión ezimática, la síntesis y los niveles endógenos de S1P descienden progresivamente a medida que las células se diferencian. Para evaluar, si existía una coordinación entre dicho descenso y la diferenciación celular, se in- hibió farmacologicamente a la SphK al momento de desencadenar la diferenciación celular y se encontró que las células no establecieron uniones adherentes maduras, manteniendo una morfo- logía fibroblastoide. Además, se encontró que las uniones adherentes no se establecieron correc- tamente porque el complejo de proteínas que lo conforma se acumulaba en el aparato de Golgi. El impedimento en el avance de las proteínas a través de la vía secretoria resultó estar mediado por la modulación que lleva a cabo la S1P sobre la síntesis de esfingolípidos, en especial por la acumulación de ceramida.Posteriormente, se evaluó si la baja actividad de la vía SphK/S1P detectada en el estado de dife- renciación celular tenía significancia biológica para la homeostasis de dicho estado. Los resultados demostraron que la inhibición de la SphK no produjo alteración de la morfología ni de las uniones adherentes, pero produjo pérdida de la integridad de la monocapa de células. Se relacionó dicha alteración con una falla en el proceso de extrusión celular, mecanismo dependiente de S1P, por el cual se eliminan células apoptóticas del tejido epitelial hacia la luz del mismo. Además, encontramos que dicho proceso es dependiente de la SphK2 y que durante la MET existe una relocalización del receptor de S1P implicado en la extrusión celular.Los resultados sugieren que, en etapas tempranas de la diferenciación celular, la vía SphK/S1P se encuentra más activa, limitando la síntesis de esfingolípidos. Sin embargo, con el avance en la diferenciación celular, progresivamente disminuye la actividad de la misma, contribuyendo a la síntesis de esfingolípidos, principalmente SM y GluCer, necesarios para el establecimiento de la unión adherente y la polaridad celular. Por otro lado, el bajo tono de síntesis en células diferencia- das moviliza al receptor desde vesículas a la membrana plasmática, posibilitando el mecanismo de extrusión celular que garantiza la homeostasis tisular. De esta manera, en este trabajo de tesis doctoral se pone en evidencia la sincronización existente entre la vía SphK/S1P, la diferenciación celular y la organización tisular.

Sphingosine kinase (SphK) biosynthesizes sphingosine-1-phosphate (S1P). S1P is a bioactive sphingolipid and has been shown to exert a variety of biological responses, intracellularly or through extracellular specific receptors. Sphingolipids are molecules that not only have a structural functionality, each one is related with a characteristic biological activity. Morover, specific molecular species are associated with specific biological actions. Renal epithelial cell differentiation is a process that involves the mesenchymal to epithelium transition (MET). During the MET, mesenchymal cells become polarized, developing an apical and a basolateral domain, at the same time establishing cell junctions. This transition is triggered by an intricate molecular signaling where extracellular hypertonicity is necessary, which is also required for maintenance of the differentiated state. Moreover, the tissue homeostasis depends on a correct cell turnover, which guarantees the integrity of the tissue and allows its functionality. The goal of this thesis was to study the role of S1P in the MET process of renal epithelial cells, as well as in the homeostasis once the differentiated state has already been established. As experimental model we used the MDCK cell line, which derived from renal collector duct cells. MDCK cells are a prototype model to study cell polarization and differentiation. Initially, we studied SphK1 / S1P pathway during the onset of cell differentiation. The results showed that the enzymatic expression, the synthesis and the endogenous levels of S1P progressively decrease as the cell becomes more differentiated. To evaluate if it was due to a coordination between the downregulation of the pathway and cell differentiation, SphK was inhibited pharmacologically at the time of triggering cell differentiation. We found that cells did not establish mature adherens junctions and maintained a fibroblastoid morphology. In addition, we found that the adherens junction proteins were accumulated in the Golgi apparatus. This protein accumulation was due to the modulation on the sphingolipid synthesis mediated by S1P. Subsequently, we evaluated whether the downregulation of the SphK / S1P pathway affected the differentiated cells. We found that the inhibition of SphK did not affect cell morphology or maduration of cell junctions, but produced loss of monolayer integrity. This alteration was related to a failure in cell extrusion, a procces in which apoptotic cells are removed from the epithelial tissue, by S1P -dependent mechanism. In addition, we found that this process was dependent on SphK2, and that during MET the S1PR2 involved in cell extrusion was relocated. The results suggested that, in early stages of cell differentiation, the pathway is more active, limiting the synthesis of sphingolipids, but progressively decrease its activity in synchrony with the progress of cell differentiation. This regulation contributes to the synthesis of sphingolipids, mainly sphingomyelin and glucosylceramide, essential for the establishment of adherens junctions and cell polarity. On the other hand, low activity of SphK in differentiated cells mobilizes the rec eptor from vesicles to the plasma membrane, activating the cell extrusion mechanism that guarantees tissue homeostasis. Finally, we propose that SphK / S1P pathway is synchronized during cellular differentiation.