Diversidad de levaduras en fruta fina de la Patagonia: selección de potenciales antagonistas de patógenos de poscosecha

Abstract

Las cerezas, frambuesas y zarzamoras se comercializan frescas y se almacenan en frío para extender su vida útil. Un problema de estos productos son las pérdidas en postcosecha causada por mohos. En nuestro país no hay fungicidas registrados para la etapa posterior a la cosecha en estas frutas. Motivo por el cual, el uso de agentes de control biológico (ACB) se propone como un método alternativo para el control de las enfermedades de postcosecha.En este marco, el objetivo general de esta tesis fue generar información sobre los mohos causantes de enfermedades de postcosecha en fruta fina; y seleccionar levaduras indígenas de Patagonia como potenciales ACB para estos patógenos. Para ello se llevó a cabo: 1) aislamiento e identificación de hongos patógenos y levaduras endo y epifíticas a partir de frutos en condiciones de producción convencional y orgánica; 2) Caracterización y selección de hongos en base a su virulencia, resistencia a fungicida y concentración infectiva mínima (CIM) , 3) Selección de levaduras antagonistas por su capacidad biocontroladora en condiciones de conservación de la fruta; 4) Determinación de mecanismos de acción involucrados en la capacidad antagónica de las levaduras seleccionadas; 5) Evaluación de la disponibilidad de agua (aw), temperatura y pH en el crecimiento de las levaduras ; 6) Determinación de la concentración efectiva mínima (CEM) de cada aislamiento de levadura.Como resultado se obtuvieron 43 aislamientos de mohos a partir de fruta con síntomas con enfermedad, determinados taxonómicamente en 5 géneros y 9 especies. La caracterización de la virulencia, CIM y resistencia al fungicida iprodione, demostró que Mucor piriformis ccCIEFAP501 y Penicillium crustosum ccCIEFAP491 son aislamientos altamente patogénicos para las frutas finas desde el almacenamiento hasta su comercialización. Ambas especies fueron aisladas de la zona del Paralelo 42°.Se obtuvieron 660 aislamientos de levaduras nativas de cerezas, frambuesas y zarzamoras, a partir de aguas de lavados, utilizando diferentes técnicas y tiempos de conservación de la fruta. Posteriormente, la evaluación de la adaptación al frío demostró que 100 aislamientos fueron capaces de crecer a 0°C (temperatura de almacenamiento de la fruta). A partir de la identificación molecular, las levaduras se distribuyeron en 9 géneros y 20 especies.Se seleccionaron 52 aislamientos de levaduras para evaluar su capacidad antagonista frente a Mucor piriformis ccCIEFAP501 y Penicillium crustosum ccCIEFAP491 en cerezas y 15 aislamientos para ensayos en frambuesas y zarzamoras. Además se evaluó la eficacia de levaduras de formulación comercial (Yield Plus y Boni Protect) y NPCC1250 Pichia membranifaciens y NPCC1263 Vishniacozyma victoriae, levaduras biocontroladoras de patógenos de pera. Las características de las frambuesas y zarzamoras, pérdida de firmeza y alto nivel de inóculo de patógenos que traen estos frutos del campo, requirieron desarrollar una metodología para la evaluación del potencial biocontrolador de las levaduras sobre la infección natural de mohos. Se determinó también, que las frambuesas y zarzamoras traen una alta carga de inóculo de Botrytis cinerea, capaz de causar el deterioro de la fruta en postcosecha, por lo que se incluyó también en los análisis posteriores.Luego, se seleccionaron los diez aislamientos de levaduras con mayor efecto sobre la virulencia (reduccion del 50% o más) de uno o ambos patógenos en fruta almacenada a 0°C y/o 22°C. La levadura comercial Yield Plus mostró resultados equiparables a los obtenidos con levaduras nativas, mientras que Bony Protect y las levaduras ACB de pera, redujeron la incidenca de los patógenos en menor porcentaje que las nativas (entre 0 -632%). Se evaluó la posibilidad de mejorar la eficacia de los ACB a través de mezclas de dos levaduras (1:1), pero estas no evidenciaron actividad sinérgica que aumente la efectividad que tienen las levaduras por separado.En cuanto a la determinación de los mecanismos de acción in vitro, vinculados a la actividad antagonista de los diez aislamientos de levaduras, se observó que: Vishniacozyma victoriae ccSL30, Aureobasidium pullulans ccSL1141 y Cystofilobasidium capitatum ccSL1204 fueron las levaduras con una batería de mecanismos de acción más amplia pero no fueron capaces de producir toxinas killer ni de competir por hierro.A partir de estas observaciones se concluyó que estos tres asilamientos presentan mayor potencial ACB, por lo cual se evaluó su comportamiento frente a cambios fisiológicos (temperatura, pH y actividad de agua (aw) y la determinación de la CEM de inoculo de ACB para obtener la mayor efectividad frente a Mucor piriformis, Penicillium crustosum, y B. cinerea. Estos ensayos mostraron que: las tres levaduras tienen mayor crecimiento en la combinación awxtemperatura 0.995 a 20°C y tolerancia a modificación del pH. A. pullulans ccSL1141 fue el que mostró mayor crecimiento a 0° y 5°C. Cystofilobasidium capitatum ccSL1204 fue capaz de crecer en todas las temperaturas, rangos de pH y aw. Las CEM de las tres levaduras se encuentran en concentraciones del orden de 107. Cystofilobasidium capitatum ccSL1204 fue la levadura más efectiva al producir reducción sobre la virulencia de los tres patógenos evaluados.De esta manera esta Tesis aporta:- los primeros registros de la diversidad de hongos y levaduras asociadas a frutas finas de Patagonia,- el primer registro de P. crustosum y M. piriformis como los patógenos más frecuentes, responsables del deterioro de cerezas, frambuesas y zarzamoras en Patagonia.- el primer estudio de la capacidad antagónica de levaduras nativas adaptadas al frío frente a patógenos de postcosecha de interés regional.- la caracterización de diez levaduras nativas adaptadas al frio con capacidad antagonista a través del estudio de los mecanismos de acción en ensayos in vitro.- información relevante para futuros procesos de producción de biomasa a gran escala a través del comportamiento de Vishniacozyma victoriae ccSL30, Aureobasidium pullulans ccSL1141 y Cystofilobasidium capitatum ccSL1204 frente a cambios fisiológicos y de la CEM para asegurar el efecto antagónico.- el primer registro y caracterización de la especie Cystofilobasidium capitatum como potencial ACB con condiciones para continuar con las etapas de desarrollo de un bioproducto por su capacidad de crecimiento en un amplio rango de temperaturas, pH, aw, espectro de acción más amplio y concentraciones efectivas bajas.

Cherries, raspberries, and blackberries (fine fruits) are marketed fresh and cold stored to extend their shelf life. A problem with these products is the postharvest losses caused by molds. In our country there are no registered fungicides for the post-harvest stage on these fruits. Reason why, the use of biological control agents (CBA) is proposed as an alternative method for the control of post-harvest diseases. Within this framework, the general objective was to generate information on molds that cause postharvest diseases in fine fruit; and select indigenous Patagonian yeasts as potential CBAs for pathogens. For this, the following was carried out: 1) isolation and identification of pathogenic fungi and endo and epiphytic yeasts from fruits under conditions of conventional and organic production; 2) Characterization and selection of fungi based on their virulence, resistance to fungicide and minimum infective concentration (MIC), 3) Selection of antagonistic yeasts for their biocontrol capacity under fruit conservation conditions; 4) Determination of mechanisms of action involved in the antagonistic capacity of the selected yeasts; 5) Evaluation of water availability (aw), temperature and pH in yeast growth; 6) Determination of the minimum effective concentration (CEM) of each yeast isolate. As a result, 43 mold isolates were obtained from fruit with symptoms of disease, taxonomically determined in 5 genera and 9 species. The characterization of virulence, MIC and resistance to the fungicide iprodione, showed that Mucor piriformis ccCIEFAP501 and Penicillium crustosum ccCIEFAP491 are highly pathogenic isolates for fine fruits from storage to marketing. Both species were isolated from the 42° Parallel zone. 660 isolates of native yeast from cherries, raspberries and blackberries were obtained from washing waters, using different techniques and fruit preservation times. Subsequently, the cold adaptation evaluation showed that 100 isolates were able to grow at 0°C (fruit storage temperature). From the molecular identification, the yeasts were distributed in 9 genera and 20 species. 52 yeast isolates were selected to evaluate their antagonistic capacity against Mucor piriformis ccCIEFAP501 and Penicillium crustosum ccCIEFAP491 in cherries and 15 isolates for tests on raspberries and blackberries. In addition, the efficacy of commercially formulated yeasts (Yield Plus and Boni Protect) and NPCC1250 Pichia membranifaciens and NPCC1263 Vishniacozyma victoriae, biocontrolling yeasts of pear pathogens, were evaluated. The characteristics of raspberries and blackberries, loss of firmness and high level of pathogen inoculum brought by these fruits from the field, required the development of a methodology for evaluating the biocontrol potential of yeasts under natural mold infection. It was also determined that raspberries and blackberries carry a high load of inoculum of Botrytis cinerea, capable of causing deterioration of the fruit in post-harvest, which is why it was also included in subsequent analyzes. Later, ten yeast isolates with the greatest effect on the virulence (reduction of 50% or more) of one or both pathogens in fruit stored at 0°C and / or 22°C were selected for their ability to reduce the virulence of Mucor piriformis ccCIEFAP501 and Penicillium crustosum ccCIEFAP491. The commercial Yield Plus yeast showed results comparable to those obtained with native yeasts, while Bony Protect and CBA pear yeasts reduced the incidence of pathogens in a lower percentage than native yeasts (between 0 - 32%). To improve the efficiency of the CBA, we performed mixtures of two yeasts (1: 1), but these did not show synergistic activity that increases the effectiveness of the yeasts separately. Regarding the determination of the mechanisms of action in vitro, linked to the antagonistic activity of the ten yeast isolates, it was observed that: Vishniacozyma victoriae ccSL30, Aureobasidium pullulans ccSL1141 and Cystofilobasidium capitatum ccSL1204 were the yeasts with a battery of broader mechanisms of action. Also, they were not capable of producing killer toxins or competing for iron. Based on these observations, it was concluded that these three isolates have a higher CBA potential, which is why its behavior against physiological changes (temperature, pH and water activity (aw) and the determination of the CEM of ACB inoculum were evaluated to obtain the greatest effectiveness against Mucor piriformis, Penicillium crustosum, and B. cinerea. These tests showed that: the three yeasts have higher growth in the combination aw x temperature 0.995 at 20°C and pH modification tolerance. A. pullulans ccSL1141 was the one that showed the highest growth at 0°C and 5°C. Cystofilobasidium capitatum ccSL1204 was able to grow at all temperatures, pH ranges, and aw. The CEM of the three yeasts are found in concentrations of the order of 107 cél/mL Cystofilobasidium capitatum ccSL1204 was the most effective yeast in producing a reduction in virulence of the three pathogens evaluated. In this way this Thesis provides: - the first records of the diversity of fungi and yeasts associated with fine fruits of Patagonia, - the first record of P. crustosum and M. piriformis as the most frequent pathogens, responsible for the deterioration of cherries, raspberries and blackberries in Patagonia. - the first study of the antagonistic capacity of native yeasts adapted to the cold against post-harvest pathogens of regional interest. - the characterization of ten native yeasts adapted to the cold with antagonistic capacity through the study of the mechanisms of action in in vitro tests. - relevant information for future large-scale biomass production processes through the behavior of Vishniacozyma victoriae ccSL30, Aureobasidium pullulans ccSL1141 and Cystofilobasidium capitatum ccSL1204 against physiological and CEM changes to ensure the antagonistic effect. - the first record and characterization of the Cystofilobasidium capitatum species as a potential CBA with conditions to continue with the stages of development of a bioproduct due to its capacity for growth in a wide range of temperatures, pH, aw, broader spectrum of action and effective concentrations low.