Residuos y subproductos derivados de la industria quesera para el crecimiento de lactobacilos mesófilos de interés industrial

Abstract

Los lactobacilos, como la mayoría de las bacterias lácticas, son microorganismos fastidiosos desde el punto de vista de sus requerimientos nutricionales ya que no pueden sintetizar muchos de los compuestos necesarios para su óptimo crecimiento (Parente et al., 2017). En consecuencia, para la producción industrial de fermentos de bacterias lácticas se requieren medios de cultivo complejos, formulados generalmente por una serie de componentes (fuentes de nitrógeno, carbono, sales, vitaminas y minerales) que los hacen muy costosos. Esto último ha motivado a las industrias de fermentos a buscar fuentes de nutrientes alternativas como residuos y subproductos agroindustriales, los cuales tienen una gran disponibilidad y son de bajo costo. En este sentido, el suero de queso y el permeado de suero de queso son residuos/subproductos caracterizados por su alto valor nutricional, por lo que ofrecen muchas posibilidades de explotación tecnológica. Por otro lado, el suero que no es industrializado es uno de los contaminantes ambientales más severos que existen en la industria láctea. Una alternativa económicamente atractiva, y a su vez amigable con el medioambiente, es la utilización de éstos como fuente de carbono para el crecimiento de bacterias lácticas de interés. El objetivo de este trabajo fue evaluar residuos/subproductos de la industria quesera para la formulación de medios de cultivos destinados al crecimiento de tres cepas de lactobacilos autóctonos de interés industrial. En una primera experiencia se evaluó el crecimiento de las cepas Lacticaseibacillus paracasei 90 (L90) y Lacticaseibacillus rhamnosus 73 (L73) en un medio de cultivo formulado con el suero de queso en polvo, preparado según el protocolo descripto por Vigliengo y Reinheimer (2009) con algunas modificaciones, ya que las proteínas del suero fueron precipitadas. Brevemente, el suero en polvo se reconstituyó en agua (concentración final de lactosa de 4%), se acidificó con ácido clorhídrico hasta pH 4 y se calentó a 100°C durante 15 min para precipitar las proteínas de suero. Posteriormente, las proteínas fueron separadas por centrifugación y el sobrenadante fue filtrado y neutralizado a pH 7. Una alícuota del sobrenadante fue esterilizada en autoclave (121°C, 15 min) para obtener un suero estéril (S). Otra alícuota del sobrenadante fue suplementada con extracto de levadura (0,5%), MgSO4 (0,02%) y MnSO4 (0,005%), y finalmente esterilizada para obtener un suero suplementado estéril (SS). Ambos medios de cultivo (S y SS) fueron inoculados al 2% v/v (~ 7 log UFC/mL) con las cepas L90 y L73 e incubados por 20 h a 37ºC. Luego de la incubación se determinó la biomasa mediante recuentos microbiológicos en placa y medición de la densidad óptica a 600nm. En una segunda experiencia se optimizó la producción de biomasa de la cepa Lactiplantibacillus plantarum 29 (L29) en un medio de cultivo líquido formulado a partir de permeado de suero en polvo. Para ello, se aplicó un diseño central compuesto, constituido por 21 puntos experimentales, de los cuales 5 fueron repeticiones del punto central. Los factores (suplementos) y sus límites (% m/v) se detallan a continuación: lactosa -proveniente del permeado- (entre 0,25 y 8,00), extracto de levadura (entre 0 y 1), MnSO4 (entre 0 y 0,0070) y MgSO4 (entre 0 y 0,0500). Luego de disolver en agua los ingredientes de cada punto del diseño, el pH del medio fue ajustado a un valor de 6,5 y finalmente todos los medios fueron esterilizados (121°C, 15 min). La cepa L29 fue inoculada en cada punto del diseño al 2% v/v (~ 7 log UFC/mL) e incubada por 20h a 37ºC. La respuesta evaluada y modelada fue la producción de biomasa medida a través de recuentos microbiológicos en placa y de la determinación gravimétrica del peso seco de las células. Los resultados obtenidos fueron procesados estadísticamente en el programa Design-Expert® 7.0.0 trial para asignar modelos matemáticos de ajuste. Los coeficientes de los modelos matemáticos de ajuste fueron calculados mediante regresión múltiple con eliminación backward y validados mediante análisis de varianza de una vía, con un nivel de significancia p<0,05. Mediante el método de superficie de respuesta se hallaron los máximos posibles de las respuestas en el rango estudiado. De esta manera, se halló la combinación de factores para lograr un medio optimizado de permeado de suero, que fue finalmente validado por triplicado. En la primera experiencia se observó que las cepas L90 y L73 lograron un crecimiento superior 8,9 log UFC/mL, en el suero de queso sin suplementar (Figura 1A). La suplementación del suero con el extracto de levadura y las sales de Mg y Mn permitieron incrementar significativamente los niveles de recuentos microbiológicos de ambas cepas respecto al suero sin suplementar. El incremento promedio observado fue de 0,15 y 0,20 log UFC/mL, para L90 y L73, respectivamente. Mientras que el incremento observado para la respuesta densidad óptica fue de 3,36 y 0,90, para L90 y L73, respectivamente. En la segunda experiencia, el modelo de ajuste del diseño de optimización permitió graficar las superficies de las respuestas evaluadas; se observó que los máximos valores de recuentos (> 9 log UFC/mL) se lograron con los niveles más elevados de extracto de levadura y lactosa (Figura 1B). La misma tendencia fue observada para la respuesta peso seco. En base a estos resultados y al costo de los ingredientes se pudo determinar la concentración de lactosa (8,00 g/100 mL), extracto de levadura (0,50 g/100 mL), MnSO4 (0,0017 g/100 mL) y MgSO4(0,0403 g/100 mL) necesarias para lograr la máxima producción de biomasa de L29. La validación del modelo permitió confirmar la respuesta teórica, ya que se lograron resultados experimentales similares a las predicciones teóricas del modelo. Los medios de cultivos derivados del suero de queso resultaron adecuados para el crecimiento de las cepas L90 y L73; la incorporación de suplementos nutricionales incrementó su rendimiento. En futuras experiencias se realizará un diseño de optimización para maximizar la producción de biomasa de ambas cepas y reducir al mínimo los nutrientes adicionados. Por otro lado, el medio de cultivo derivado del permeado de suero de queso y optimizado para la producción de L29 permitió obtener niveles tan altos como los requeridos a nivel industrial.