La vía fosfolipasa D modula el proceso autofágico en las células del epitelio pigmentario de la retina expuestas a estrés inflamatorio

Abstract

Objetivos: la autofagia es un proceso catabólico altamente activo en las células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) y cuya desregulación ha sido asociada a la patogénesis de diversas enfermedades degenerativas de la retina. Resultados previos de nuestro laboratorio demostraron la participación de las isoformas clásicas de la fosfolipasa D (PLD1 y PLD2) en la respuesta inflamatoria de las células del RPE. El objetivo del presente trabajo es caracterizar el proceso autofágico, y su modulación por la vía PLD, en las células del RPE expuestas a un modelo inflamatorio inducido por lipopolisacárido (LPS). Métodos: células de RPE humanas (líneas D407 y ARPE-19) se expusieron a LPS (10 o 25 μg/ml) por 24 o 48 h. Se realizaron ensayos de western blot e inmunofluorescencia para evaluar el contenido de LC3II y SQSTM1/p62 (marcadores de autofagosomas) y la presencia de estructuras intracelulares punteadas p62- y LC3-positivas. Se utilizó bafilomicina A1 (BAF, 50 nM) para bloquear el flujo autofágico e inhibidores tempranos de la autofagia, 3-metiladenina (3- MA, 2 y 5 mM) y LY294002 (10 μM). El rol de la vía PLD se estudió utilizando inhibidores selectivos de PLD1 (VU0359595, 0.5 o 5μM) o PLD2 (VU0285655-1, 0.5 o 5μM). La viabilidad celular se evaluó por la técnica de reducción del MTT. Resultados: el LPS indujo un aumento en los niveles de estrés oxidativo y en la activación del factor NFκB y una disminución de viabilidad de las células del RPE. Además, la exposición a LPS incrementó los niveles de LC3II y el contenido de estructuras punteadas LC3- y p62 positivas, tanto en células D407 como en ARPE-19. El bloqueo del flujo autofágico con BAF corroboró que el LPS induce la activación de la autofagia en las células del RPE. Por su parte, la inhibición de PLD1 y PLD2 incrementó los niveles de LC3II y el contenido de estructuras punteadas LC3- y p62- positivas inducidos por LPS. La inhibición de la autofagia con 3-MA y LY294002 empeoró la pérdida de viabilidad celular inducida por LPS mientras que los inhibidores de PLD1 y PLD2 previnieron la pérdida de viabilidad. Conclusiones: nuestros resultados demuestran que en condiciones inflamatorias se reduce la viabilidad celular y aumenta la autofagia en las células del RPE. Nuestros hallazgos sugieren que el proceso autofágico mediaría protección celular frente a una injuria inflamatoria y que ambas isoformas de PLD serían capaces de modular dicho proceso.