Estudio de parámetros involucrados en la transformación genética de la caña de azúcar (Saccharum spp) mediante embriogénesis directa

Abstract

El tiempo promedio requerido para regenerar una planta transgénica completaa partir de callos embriogénicos (Embriogénesis Somática Indirecta, ESI) es de seis anueve meses. La embriogénesis somática directa (ESD) es una vía morfogénica alternativaque permite obtener embriones somáticos directamente desde células aisladas o gruposde células sin la formación del callo, lo cual conlleva diversas ventajas tales como ladisminución en el tiempo de regeneración, el menor número de subcultivos y una menorprobabilidad de aparición de variantes somaclonales. Además, otros parámetros del procesode transformación como tipo de microproyectiles, edad de los embriones somáticos ycantidad de ADN pueden afectar la eficiencia del mismo. El objetivo del presente trabajofue estudiar la eficiencia de transformación genética de la variedad comercial local de cañade azúcar TUC 95-10 a partir de explantos obtenidos por ESD. Se ensayaron, asimismo,las variables tipo de micropartículas, edad de los embriones somáticos y cantidad deADN mediante el uso del gen reportero gfp (del inglés “green fluorescent protein”), bajo laregulación del promotor constitutivo CaMV35S. El mayor número de puntos de expresiónestables (puntos GFP) se observó cuando los bombardeos se efectuaron con partículas deoro. En la evaluación de las diferentes edades de los embriones somáticos (10 y 18 días)y concentraciones de ADN (2,5 y 5 µg) no se observaron diferencias significativas en elnúmero de puntos GFP. Los resultados sugieren que la utilización de partículas de oro conuna concentración de ADN de 2,5 µg y explantos de discos de hojas de 10 días mejorala eficiencia del protocolo de transformación genética en caña de azúcar, reduciendo eltiempo y la cantidad de ADN requeridos.

The average time required to regenerate a complete transgenic plant from embryogenic calli (Indirect Somatic Embryogenesis, ESI) is 6 to 9 months. Direct somatic embryogenesis (ESD) is an alternative morphogenic pathway that allows obtaining somatic embryos directly from isolated cells or groups of cells without the formation of callus, which has several advantages such as the reduction in regeneration time, the lower number of subcultures and a lower probability of somaclonal variation. In addition, other parameters of the transformation process such as the type of microprojectiles, the age of the somatic embryos and the amount of DNA can affect its efficiency. The objective of the present work was to study the genetic transformation efficiency of the local commercial sugarcane variety TUC 95-10 from explants obtained by ESD. Likewise, the variables type of microparticles, age of the somatic embryos and amount of DNA were analized by using the reporter gene gfp (“green fluorescent protein”), under the regulation of the constitutive promoter CaMV35S. The highest number of stable expression points (GFP points) was observed when bombardments were carried out with gold particles. In the evaluation of the different ages of the somatic embryos (10 and 18 days) and DNA concentrations (2.5 and 5 µg), no significant differences were observed in the number of GFP points. The observed results suggest that the use of gold particles with a DNA concentration of 2.5 µg and explants of 10-day-old leaf discs improves the efficiency of the genetic transformation protocol in sugarcane.