Acumulación diferencial de Galectina 1 humana en plantas transplastómicas de tabaco asociada a mutaciones aminoacídicas puntuales

Abstract

Las plantas transplastómicas se destacan entre otros sistemas de biorreactores por su capacidad comprobada para alcanzar niveles de acumulación de péptidos recombinantes excepcionalmente elevados (>50% de la proteína soluble total; PST) sin los requerimientos de infraestructura asociados a biorreactores celulares. Sin embargo, en algunos casos se han informado niveles bajos e incluso indetectables de expresión de proteína heteróloga, por causas pobremente comprendidas. En este marco, el objetivo de este trabajo ha sido evaluar la factibilidad de producir plantas transplastómicas de tabaco capaces de expresar Galectina 1 humana (hGal-1) analizando cambios en su acumulación asociados a mutaciones aminoacídicas puntuales. hGal-1 resulta una proteína de interés debido a su potencial terapéutico asociado a sus actividades inmunomoduladoras y antiinflamatorias ampliamente reportadas. Asimismo, presenta características bioquímicas compatibles con el sistema de expresión plastídico ya que carece de modificaciones postraduccionales impropias del cloroplasto como la glicosilación.Inicialmente, clonamos en el vector de transformación plastídico el gen LGALS1 y dos variantes (V1 y V2), desarrolladas en el laboratorio del Dr. Gabriel Rabinovich mediante modificaciones aminoacídicas puntuales. Las tres construcciones (G1, V1, V2) se utilizaron para transformar plantas de Nicotiana tabacum usando biobalística. A partir de tres eventos de recombinación homóloga independientes para cada construcción (verificados por PCR), se obtuvieron nueve líneas transplastómicas. Todas las líneas resultaron capaces de expresar la proteína de interés de acuerdo a los resultados observados mediante Western blot. En ningún caso se apreciaron diferencias en el patrón electroforético respecto al estándar de hGal-1 funcional. El posterior análisis a nivel molecular permitió confirmar la homoplastía de las nueve líneas por medio tanto de la técnica de Southern blot como por el análisis de segregación, germinando semillas en medio selectivo. La actividad transcripcional del transgén resultó corroborada por Northern blot, sin que se observen diferencias apreciables entre las nueve líneas analizadas. Mediante ELISA cuantificamos la acumulación de proteína recombinante (G1: 0,04%PST; V1: 0,01%PST; V2: 0,02%PST).Destacablemente pudimos observar que una o dos modificaciones puntuales en la secuencia aminoacídica del transgén resultaron capaces de alterar significativamente los niveles de acumulación en el estroma plastídico. Esta diferencia de acumulación radica en factores postraduccionales asociados a la estabilidad proteica en el estroma del cloroplasto dado que no se observaron diferencias en la acumulación de transcriptos asociados al transgén. Los presentes resultados podrían ayudar a comprender mejor los factores limitantes asociados a la expresión de proteínas heterólogas en cloroplastos con el objetivo de aprovechar el potencial de este sistema.