Bone vascular actions of the nutraceutical genistein

Abstract

Los fitoestrógenos (FE) como la isoflavona Genisteina (Gen) son suplementos dietarios propuestos como alternativa natural para reducir riesgo de fracturas asociada a osteoporosis menopáusica. La reparación ósea depende de la revascularización (angiogénesis) que aporta factores y precursores OB que al diferenciarse adquieren capacidad de formación y mineralización ósea. La proliferación y migración de CE y síntesis de VEGF, son eventos cruciales que conducen a la formación de los neocapilares. La regeneración ósea también puede promoverse con el aporte de la bioingeniería a través del uso de nanopartículas de sílice (NPMsi). Previamente demostramos que Gen modula la interacción entre los sistemas óseo y vascular (O-V) favoreciendo la diferenciación de células óseas indirectamente a través de su acción vascular. El objetivo del trabajo fue evaluar el rol de Gen sobre los procesos vinculados a la reparación ósea descriptos anteriormente. Modelo experimental: se emplearon de ratas Wistar hembras de 1- 3 semanas de edad a partir de las cuales se obtuvieron: anillos de aorta (AA); cultivos primarios de células endoteliales aórticas (CE) y de osteoblastos de calvaria (OB). Se trataron in vitro con Gen (1 nM-5 μM) por 24-72 h. Primeramente estudiamos el efecto de Gen sobre la proliferación de CE. El FE estimuló el crecimiento celular en todo el rango de concentraciones estudiada (22-39% s/c, p< 0.01, Gen 1nM- 1 μM). Al evaluar la acción del FE sobre la producción de VEGF (inmunoensayo) observamos un aumento significativo de la expresión del proangiogénico (64.19±3.68 vs 38.01±4.24 pg VEGF/mg prot; Gen vs C, p <0.001). eguntamos si la acción de Gen sobre la angiogénesis depende de su acción regulatoria O-V. Para ello, se realizaron ensayos con medios condicionados (MC) provenientes de OB em cultivo tratados con Gen (24 h). Se midió su efecto sobre la migración de CE (ensayo de reparación de herida). La presencia del MC potenció el estímulo en la migración inducido tratamiento directo con Gen (72 h) (187% vs 30% s/c en presencia o ausencia de MC, p<0,05). La formación de neocapilares se abordó sembrando AA en un soporte proteico por 5 días en presencia o en ausencia de MC proveniente de OB pre-tratados con Gen 10 nM (12 días). Se cuantificaron los tubos formados por microscópica óptica. En presencia del MC los AA exhibieron un mayor número de estructuras tridimensionales y tubulares alrededor de los anillos. Finalmente estudiamos el rol NMPs de sílice sobre la diferenciación se OB inducida por Gen. OB fueron incubados NPMsi (1 μg/mL) durante 15 días en presencia de Gen 10nM. El cotratamiento de NMPsi +Gen estimuló significativamente la actividad FAL y la calcificación de la matriz ósea. Los resultados presentados sugieren una acción beneficiosa del FE promoviendo la interacción O-V, estimulando los procesos celulares involucrados en la reparación ósea y favoreciendo la acción de biomateriales de regeneración tisular.

Previously we reported that the phytoestrogen (PE) Genistein (Gen) prevents the atherosclerotic plaque genesis via estrogen receptor (ER) activation and the inhibition of the cellular/molecular events involved in vascular damage. Indeed, vascular muscle cell transdifferentation into osteoblasts (OB) like cells was also impaired. Here we studied the role of Gen on the bone-vascular axis interaction with focus on OB growth and angiogenesis. To that end, aortic rings (AR), primary cultures of aortic endothelial cells (EC) and calvaria OB isolated from female Wistar rats, exposed to Gen (10nM-1uM) were employed. OB proliferation and differentiation are regulated by several factors such as BMP-2, Runx2 and the bioactive compound NO. We showed that short term exposure of OB to Gen enhanced NO production (33-20% above C, 15-30 min treatment, p<0.05, Griess reaction). NO was involved in OB proliferation since in presence of a nitric oxide synthase inhibitor, L-NAME (10uM), OB growth was blunted (p<0.001). In RT-PCR assays we found that Gen significantly increased Runx2 and BMP-2 mRNA levels. The PE genomic action was extended to an up-regulation of alpha and beta ER mRNA expression (p<0.05). Angiogenesis depends on EC proliferation and migration that finally lead to capillary formation. These events were evaluated using conditioned medium (CM) obtained from OB exposed to Gen (72h). CM stimulated EC proliferation (0.47±0.07 vs 0.38±0.07, Gen vs C, p<0.02, MTT technique) and markedly enhanced EC migration (30;187% above C, Gen 10;100nM, p<0.05, wound healing assays). Capillaries formation was studied by seeding AR on a collagen matrix for 15 days in presence or absence of CM and quantified by optical microscopy. A high number of three-dimensional tubular structures around AR were detected. This work provided evidence of OB maturation induced by Gen with beneficial impact on vascular tissue promoting angiogenesis, crucial events involved in bone formation and remodeling.