Estudio de expresión diferencial de proteínas intracelulares de Apiotrichum loubieri M12 en presencia de Cu(II)

Abstract

{Apiotrichum loubieri} M12, un microorganismo resistente a Cu(II), fue aislado a partir de sedimentos de un ambiente afectado por Drenaje Ácido de Mina en la provincia de San Luis. En estudios previos, este microorganismo fue capaz de remover alrededor del 35% de Cu(II) cuando creció en medio líquido con 40 µg mL^-1 Cu(II) después de 48h de incubación. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la expresión diferencial de proteínas intracelulares de {A. loubieri} M12 en presencia y en ausencia de Cu(II), con el fin de entender los mecanismos homeostáticos de resistencia empleados por este microorganismo.{A. loubieri} M12 se cultivó en medio EG* (g L^-1: glucosa 10,0; extracto de levadura 1,0; K_2HPO_4 0,5; KH_2PO_4 0,5), suplementado o no con 40 µg mL^-1 Cu(II), durante 48h a 30°C y 200rpm. Las células se recuperaron por centrifugaron a 4.000 {xg} durante 20min a 4°C (Centrífuga U-320R). Los pellets celulares se lavaron dos veces con PBS (mM: NaCl 124; NaH_2PO_4 10; KH_2PO_4 3) y se conservaron durante 24h a -20°C. Luego, se procedió a la ruptura mecánica de los mismos en mortero, utilizando N_2 líquido. El polvo obtenido se recuperó con 5mL de Buffer Tris-Sacarosa y se centrifugó a 8.500 {xg} durante 20min a 4°C para eliminar los restos celulares. Los sobrenadantes se utilizaron como fuente de proteínas citosólicas y se conservaron a -20°C. La concentración de proteínas se determinó con el método de Bradford y se liofilizó un volumen correspondiente a 300 µg de proteínas. Las muestras fueron reconstituidas en Buffer Tris-HCl 50mM (pH=8) a 1 µg µL^-1. Las proteínas fueron reducidas y alquiladas usando DTT y Iodoacetamida, respectivamente, y digeridas con Tripsina (Promega). El análisis se llevó a cabo a través de nanoUHPLC-ESI-MS/MS y herramientas bioinformáticas, utilizando bases de datos de Swiss-Prot y MASCOT v2.5.1. El estudio comparativo se llevó a cabo por medio de ProteoIQ v2.8. Se trabajó con triplicados biológicos y duplicados analíticos de cada uno de ellos.Las proteínas que fueron inducidas o sobre-expresadas en presencia de Cu(II) corresponden a proteínas relacionadas a: i) biosíntesis de proteínas, como proteínas ribosomales, factores de iniciación y elongación de la traducción, proteínas de splicing de ARNm y proteínas de plegamiento; ii) degradación de proteínas defectuosas, como proteasas, y proteínas de proteosoma y ubiquitinación; iii) procesos de óxido-reducción; iv) proteínas de unión a ácidos nucleicos; v) proteínas de estrés, como proteínas de choque térmico, y vi) quinasas/fosfatasas que pueden ser claves en la activación o inactivación de vías de señalización intracelulares. Estos resultados indican que la presencia del metal en el medio de cultivo afecta la expresión de proteínas celulares y fundamentalmente estimula la producción de proteínas que le permiten al microorganismo hacer frente al estrés causado por este compuesto tóxico.