Establecimiento de una única curva estándar para cuantificación de las poblaciones naturales de Trypanosoma cruzi utilizando una secuencia consenso de ADN satélite sintética

Abstract

La enfermedad de Chagas (ECh), causada por Trypanosoma cruzi, originalmente endémica de las Américas se ha extendido a países no endémicos debido a las migraciones, haciendo de las herramientas de diagnóstico y marcadores de la respuesta parasitológica al tratamiento necesidades prioritarias. La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) se utiliza para la monitorización de pacientes con ECh, sin embargo, el número de copias y la secuencia de los genes utilizados como dianas moleculares presentan variabilidad entre las variantes genéticas de T. cruzi, limitando la precisión de las medidas cuantitativas. Con el objetivo de mejorar la precisión de la cuantificación por qPCR, hemos diseñado una molécula de ADN sintético con una secuencia de ADN satélite consenso (SatDNA) como estándar para la cuantificación de cargas de T. cruzi en muestras clínicas, independientemente de la cepa del parásito. El ADN sintético permitió la cuantificación de copias de SatDNA representativas de las diferentes unidades de tipificación discreta (UDT). Las cepas pertenecientes a UDT II, IV y V presentaron valores entre 1,21±0,38 - 2,13±1,16 x10^6 copias de satDNA/genoma. Las cepas pertenecientes a UDT III y VI exhibieron 8,29±3,32 y 7,60±2,71 x10^6 copias/genoma, respectivamente, y la cepa UDT I mostró 0,25±0,06 x10*^6 copias/genoma. Una curva estándar basada en este ADN sintético permitió estimar las cargas parasitarias en pacientes con ECh de diferentes áreas geográficas infectados con diferentes genotipos parasitarios. Se obtuvo una alta concordancia de cargas al comparar los resultados obtenidos con las curvas estándar basadas en ADN extraído de sangre enriquecida con parásitos de cultivo. Este enfoque será valioso en los ensayos clínicos de fase III que incluyan pacientes de diferentes procedencias geográficas, para el seguimiento de pacientes con riesgo de reactivación de la ECh por inmunosupresión, así como en modelos experimentales que trabajen con diferentes cepas de T. cruzi.