Caracterización de los mecanismos moleculares involucrados en la endocitosis compensatoria en ovocitos activados

Abstract

El espermatozoide fertilizante genera en el ovocito una serie de cambios que en su conjunto se denominan “activación ovocitaria”. Uno de ellos es la exocitosis de gránulos corticales que está involucrada en el bloqueo de poliespermia. Recientemente hemos descripto que luego de la exocitosis masiva de gránulos corticales ocurre un proceso de endocitosis compensatoria (EC), probablemente como un mecanismo para mantener la homeostasis de la membrana. El objetivo del presente trabajo fue profundizar acerca de las vías endocíticas que podrían estar involucradas en este proceso de internalización. En primer lugar observamos que luego de la activación con SrCl2, el exudado cortical presente en la membrana del ovocito, teñido utilizando rodamina acoplada a Lens Culinaris Agglutinin (LCA), disminuyó significativamente a lo largo del tiempo, consistente con la ocurrencia de mecanismos endocíticos. Por el contrario, esta reducción no se observó en ovocitos activados con ionóforo de Ca2+, en los cuales la EC no se encuentra activa, reforzando la idea de que diferentes métodos de activación producen diferentes eventos celulares subsiguientes. Por otro lado, la EC fue evaluada mediante experimentos de pulso y caza en ovocitos de ratón activados con SrCl2, tiñendo el exudado cortical con LCA, en presencia de distintos inhibidores. Evaluamos el rol de la dinámica de los filamentos de actina en la EC utilizando disruptores del citoesqueleto (Citocalasina D 10 μM y Latrunculina A 10 μM) o un estabilizador de microfilamentos (Jasplakinolide, 0.5 μM) luego de la activación con SrCl2. Todos estos compuestos produjeron un marcado descenso en la internalización de la marca de LCA. Finalmente, evaluamos el efecto de inhibidores de distintas vías endocíticas sobre la EC. Ni Filipina 5 μM, que inhibe la endocitosis mediada por caveolas, ni PitStop 2 15 μM, un bloqueador del dominio N-terminal de la clatrina, redujeron la cantidad de marca de LCA internalizada. En contraste, la adición de dynasore 80 μM, un inhibidor de la dinamina, generó una disminución significativa en la internalización de LCA. Estos resultados indican que la EC que ocurre en ovocitos de ratón activados es independiente de las vías endocíticas mediadas por clatrina y caveolas, pero depende de la dinámica del citoesqueleto de actina y de la actividad de dinamina.