Efecto de la concentración de fosfato inorgánico presente en el medio de cultivo sobre la acumulación de polifosfato en Lactobacillus Rhamnosus CRL 1505

Abstract

Introducción y Objetivos: Polifosfato inorgánico (polyP) es un polímero lineal compuesto por decenas o cientos de residuos de ortofosfato unidos por enlaces fosfoanhídridos de alta energía, que se encuentra presente en todos los seres vivos. Numerosas funciones biológicas son atribuidas a polyP, entre las que podemos destacar reservorio de energía y fosfato, quelante de metales, tampón contra álcali y ajustes fisiológicos durante el crecimiento, desarrollo y estrés. La acumulación de polyP por algunos géneros bacterianos, tanto Gram negativos como Gram positivos, es dependiente de la concentración de Pi del medio de cultivo. En trabajos previos, se ha demostrado mediante microscopía electrónica de transmisión y fluorescencia que el inmunobiótico L. rhamnosusCRL1505 (CRL1505) es capaz de acumular en su citoplasma polyP. En base a lo expuesto, el objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la concentración de Pi del medio de cultivo sobre la acumulación de polyP por L. rhamnosus CRL1505.Materiales y Métodos: El inmunobiótico CRL1505 fue cultivado en medio MCM con diferentes concentraciones de Pi [9,2 g/L (MCM) y 0,64 g/L (MCM-)] a 37°C y se determinaron parámetros de crecimiento (recuento enplaca) y acidificación (pH) a las 24 hs de fermentación. Las células fueron cosechadas en fase estacionaria de crecimiento (20 hs) a fin de comparar la acumulación de polyP mediante tinción específica para polyP (coloración de Neisser) y cuantificación de fosfatos solubles intracelulares (técnica espectrofométrica). Para estimar el PM de polyP acumulado por CRL1505 se empleó la técnica de electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE), utilizando como marcador de PM un polyP sintético constituido por 45 residuos de ortofosfato (PM 4748 Da). Asimismo, mediante RT-PCR se evaluó la funcionalidad de los genes (ppk, ppx1 y ppx2) que codifican para las enzimas que participan en el metabolismo de polyP en ambas condiciones de cultivo.Resultados: El crecimiento de CRL1505 fue ca. 0,5 unidades logarítmicas mayor en los cultivos MCM respecto a MCM- (9,03 ± 0,13 log UFC/mL y 8,68 ± 0,18 log UFC/mL, respectivamente).No se observaron diferencias significativas (p> 0.05) en el pH luego de 20 hs de fermentación. La concentración de fosfatos solubles intracelulares fue 6,7 veces mayor en CRL1505 cultivada medio MCM respecto a las cultivadas en MCM-. Este resultado en medio MCM fue corroborado mediante electroforesis de polyP, estimándose además que el PM del polyP acumulado por CRL1505 sería superior a 4748 Da. Respecto a la expresión de los genes involucrados en el metabolismo de polyP, se observó que los tres genes son funcionales en CRL1505 en ambas condiciones de cultivo.Conclusiones: En base a los resultados obtenidos podemos concluir que existe una relación directa entre la concentración Pi del medio de cultivo y la acumulación de polyP en L. rhamnosus CRL1505, siendo ésta mayor cuanto mayor es la concentración de Pi.