Nanoanticuerpos VHH mono y multivalentes contra el virus de Influenza A de aplicación profiláctica y terapéutica

Abstract

El virus de la influenza tipo A continúa siendo responsable de brotes y epidemias, además de pandemias con graves consecuencias para la salud humana. Luego de la Pandemia del año 2009, los virus H1N1 se establecieron en la población humana como virus estacionales junto a los virus H3N2, y han representado el subtipo prevalente. La hemaglutinina (HA) es el antígeno inmunodominante que contiene en su dominio globular (HA1) el sitio de unión al receptor celular (RBS) que induce anticuerpos neutralizantes asociados con la protección contra la infección. En el presente trabajo se caracterizaron nanoanticuerpos (VHHs) derivados de llama inmune específicos para el virus de la influenza tipo A, con el fin de investigar su potencial como herramienta terapéutica. Se seleccionaron 10 VHHs específicos contra H1N1. Dos VHHs (B33 y D81) mostraron unión específica contra los subtipos H1, H5 y H3, y reconocieron epítopes lineales. B33 se unió cerca del N-terminal del tallo de HA (HA2) y D81 se unió cerca del C-terminal de HA1. Debido a su amplio rango de reconocimiento, los VHH B33 y D81 podrían considerarse candidatos para perfeccionar las herramientas de diagnóstico. Cinco VHH neutralizantes (A5, D81, D91, E13 y G41) reconocieron epítopes ubicados en HA1. E13 y G41 reconocieron epítopes conformacionales en HA1, y mostraron capacidad neutralizante contra otros 6 virus de origen humano, aviar y porcino, aislados entre los años 1934 y 2018. Este último dato sugiriere que el epítope involucrado en el reconocimiento sería altamente conservado, requisito necesario para la elección de una herramienta terapéutica de aplicación universal. En el modelo ratón, VHH E13 mostro efecto profiláctico esterilizante contra los virus H1N1 (hu/Arg/09, hu/Arg/09 ma, y hu/PR8/34) en todo el rango de dosis administradas (5 mg/kg a 0,05 mg/kg), y no fue posible detectar virus en los pulmones de los animales tratados el día 4 después de la exposición. Por otro lado, G41 mostró un efecto profiláctico específico frente a la cepa hu/Arg/09 (dosis 5mg/Kg) y una protección parcial frente a la misma adaptada al ratón y frente al hu/PR8/34, logrando en el 100% de los animales el mantenimiento del peso a lo largo del ensayo. Se destaca la capacidad de E13 para controlar la infección por H1N1 en ratones, respaldando su desarrollo como un inmuno-terapéutico para la profilaxis y el tratamiento del virus de la influenza. Por otro lado, se encontraron eficacias profilácticas similares para los VHHs E13 y G41 expresados en P. Pastoris, lo cual evidencia la factibilidad de la elaboración de estos VHHs en un sistema de expresión frecuentemente utilizado por la industria farmacéutica. A su vez, el estudio de la respuesta inmune humoral, viéndose disminuida en los animales que reciben tratamiento específico con E13, o con G41, demostrando que la inmunidad pasiva desata un menor compromiso de la respuesta inmune endógena en los individuos tratados. Adicionalmente, no se observó una respuesta específica contra los VHHs suministrados lo que agrega un dato de seguridad de los VHHs terapéuticos. Por otro lado, a través de un nuevo biopaneo, se realizó la búsqueda de nanoanticuerpos específicos contra el virus H3N2 hu/Perth/09, utilizando la técnica display en fagos. Para la selección de los VHHs se utilizó el virus H3N2 hu/Perth/09 producido en células MDCK y purificado con una columna de intercambio iónico Sartobind Q lo que favoreció la eliminación de restos celulares . De los 26 clones obtenidos fue posible obtener las secuencias de 14 VHHs, y se evidenciaron al menos 8 clones disponibles para su posterior caracterización. A su vez, en el presente trabajo se presenta la puesta a punto del modelo cobayo de infección con virus influenza, el cual no requiere de la adaptación de los virus de origen humano, con potencial aplicación a la eficacia tanto terapéutica como profiláctica de los VHHs, como así también el estudio del bloqueo de la transmisión viral por contacto. De los resultados anteriores se desprende que la administración local de VHHs neutralizantes, E13 y G41 otorgan protección total frente a la infección viral con virus influenza H1N1, y respalda su desarrollo posterior como componente activo de inmunoterapéuticos y su transferencia a la clínica médica.