Desarrollo de un método para purificar anticuerpos basado en el empleo de fusiones de dominios de unión a inmunoglobulinas a polímeros similares a elastina

Abstract

Los anticuerpos (Abs) constituyen el grupode biológicos de mayor precio y demanda. Su proceso downstream emplea rellenoscromatográficos que contienen proteína A que son de los más onerosos delmercado. El desarrollo de procesos más económicos es de sumo interés y laprecipitación selectiva constituye una buena alternativa. El objetivo de estetrabajo fue la construcción, síntesis y caracterización de moléculas que puedanser utilizadas en precipitaciones selectivas de Abs de diferentesespecies. Estas molé- culas estáncompuestas por dos partes. Por un lado, los dominios Y que reconocen espe-cíficamente Abs. Se emplearon la proteína A de Staphylococcusaureus(A), laproteína G de Streptococcus(G) o un dímero del do- minio Z (derivado de A). Porotro lado, los polipéptidos similares a elastina (ELP, elas-tinlikepolypeptide) que son polímeros artifi- ciales formados por repeticionesde un pen- tapéptido (VPGXG)n, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina,y n la cantidad de repeticiones del pentapeptido. Los ELP poseen lacaracterística de sufrir transicio- nes térmicas tornándose insolubles a unatemperatura superior a la Tt (temperatura de transición) lo que permite su separaciónde otras proteínas que permanecen solubles por no sufrir transiciones. La Ttdepende del aminoácido X y del n. En este trabajo se uti- lizaron ELP conX=Valina y n= 40 (ELP40), 80 (ELP80) o 120 (ELP120). Los genes codifi- cantespara ambas partes fueron multime- rizados para obtener los ELP40-ZZ, ELP40-G,ELP40-A, ELP80-ZZ, ELP80-G, ELP120-ZZ, y ELP120-A. Estas fusiones fueronsubclona- das en el vector de expresión pET200 y sin- tetizadas en E.coli BL21.Los rendimientos de producción fueron 4 mg/ml para los ELP40 y aproximadamente2 mg/ml para los ELP80 y ELP120. Los distintos ELP fueron purificados por ITC(inversetransitioncycling), emplean- do concentraciones de NaCl 3M, 2M y 1Mpara los ELP40, 80 y 120, respectivamen- te. Las temperaturas utilizadas fueron55°C para ELP40 y 45°C para los ELP80 y 120 y los rendimientos obtenidos fuerondel 90% con una única ITC. Los ELP-Y fueron utilizados en la purificación desueros de caballo, cone- jo y cabra y ascitis. La unión a los Abs a los ELP-Yse realizó por incubación pH 7,4. a 4°C. Posteriormente se adicionó NaCl, seaumen- tó la temperatura, y los complejos ELP-Y-Abs fueron separados porcentrifugación. El pre- cipitado se resuspendió a buffer pH 2,7 y los ELP-Yfueron separados de los Abs por ITC. La fracción soluble se neutralizó conbuffer pH 9. Todos los ELP-Y mostraron capacidad de unión a IgGs pero losmayores rendimientos y grados de pureza se obtuvieron con los ELP80-G. LosELP-Y fueron producidos y purificados utilizan- do procedimientos de bajo costoy constituyen un método alternativo costo efectivo para la purificación deanticuerpos.